홍조류 생리학을 평가하기 위한 자가형광 이미징

요약

본 프로토콜은 스펙트럼 분석을 기반으로 홍조류의 phycobiliprotein 변화의 단계별 자가형광 이미징 및 평가를 설명합니다. 이것은 실험실 조건에서 희소한 물질만 사용할 수 있고 세포가 천천히 성장하거나 전혀 성장하지 않는 극한 서식지에 대한 세포 적응을 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴 방법입니다.

초록

홍조류 (Rhodophyta)는 phycobiliproteins를 함유하고 희미한 빛으로 서식지를 식민지화하지만 일부 (예 : 일부 Chroothece 종)는 햇빛이 가득한 곳에서도 자랄 수 있습니다. 대부분의 rhodophytes는 빨간색이지만 일부는 파란색과 빨간색 담즙 단백질 (phycocyanin 및 phycoerythrin)의 비율에 따라 푸르스름하게 보일 수 있습니다. 다른 phycobiliproteins는 다양한 파장에서 빛을 포착하여 엽록소 a로 전달할 수 있으며, 이는 매우 다른 빛 조건에서 광합성을 가능하게합니다. 이 색소는 빛의 서식지 변화에 반응하며 자가 형광은 생물학적 과정을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. Chroothece mobilis 를 모델 유기체로 사용하고 컨포칼 현미경의 스펙트럼 람다 스캔 모드를 사용하여 종의 최적 성장 조건을 추측하기 위해 세포 수준에서 다양한 단색광에 대한 광합성 색소의 적응을 연구했습니다. 결과는 연구 된 균주가 동굴에서 분리 된 경우에도 희미하고 중간 정도의 광도에 적응한다는 것을 보여주었습니다. 제시된 방법은 일반적으로 극한 서식지에 사는 사람들의 경우인 실험실 조건에서 매우 느리게 성장하거나 성장하지 않는 광합성 유기체를 연구하는 데 특히 유용합니다.

서론

Chroothece 속과 같은 홍조류는 극한의 서식지에서 자랄 수 있으며, 극한의 서식지에서 자주 나타나 뚜렷한 환경 변화에 대처해야 한다¹. 홍수와 가뭄은 이 속이 발견되는 반건조 지역에서 빈번하며, 일부 종은 개울, 절벽, 동굴 또는 심지어 온천수에서도 보고되었다². 그러나 대부분의 경우 경쟁이나 방목과 같은 생물학적 변수는 종을 성장을위한 최적이 아닌 조건으로 강등시킵니다. 이러한 유기체는 종종 배양하기 어렵고 실험실 조건에서 성장하지 않거나 매우 느리게 성장하기 때문에 한 가지 주요 제한 사항은 사용 가능한 샘플 크기입니다. 따라서 비파괴 방법 또는 최소한의 샘플 조작을 포함하는 방법을 따르는 것이 매우 중요합니다 ^3,4.

이러한 혹독한 환경에서 생존하는 데 필요한 생리적 기술은 광합성 시스템의 변화를 추적하여 모니터링 할 수 있습니다. 대사 기전, 광합성 효율 및 빛 또는 배양 조건에 대한 민감도는 에너지 전달 또는 포획의 정확한 변화로 인해 색소 형광 방출 프로파일에 의해 밝혀질 수 있습니다 5,6,7,8.

세포 화합물의 자가형광은 세포 진단을 위한 마커로 사용되거나, 방출의 변화를 통한 외부 및 내부 신호에 반응하여 세포 상태 또는 대사의 자연 지표로 사용될 수 있다⁹. 또한 분류학적으로 다른 광합성 생물 그룹을 구별하는 데 사용할 수 있다¹⁰. 광영양 미생물의 계통발생학적 위치에 따라 다양한 생체 내 형광 특징을 찾을 수 있습니다. 그러므로, 광영양 형광(형광 흡수 및 방출 스펙트럼 포함)의 생체 내 특성에 기초한 분류학적 동정이 여러 차례 시도되었다^11,12. 식물성 플랑크톤 분류군 간의 부속 색소의 다양성 때문에, 엽록소 a(Chla) 형광이 자극되는 파장의 차이 또는 방출 스펙트럼의 차이를 사용하여 분류법을 추론할 수 있다¹³. 이 표본의 생체 내 형광 여기 및 방출 스펙트럼은 조류의 문뿐만 아니라 광계 적응에도 의존한다¹⁴. Chla에 대한 에너지 전달 효율, 또는 부속 색소에 대한 Chla의 비율, 세포 색소 함량은 성장 조건에 민감하다⁵.

홍조류, 특히 Chroothece는 몇 가지 보조 형광 색소 인 phycobiliproteins와 카로티노이드를 가지고 있습니다. 전자는 엽록체의 틸라코이드에 부착 된 phycobilisomes에 집중합니다. 피코빌리단백질(피코시아닌, 피코에리트린, 알로피코시아닌)은 서로 다른 파장의 빛을 포착하여 Chl a로 투과시킬 수 있으며, 이는 매우 다른 빛과 배양 조건에서 광합성을 가능하게 한다¹⁵. 예를 들어, Chroothece 종은 동굴 내부에서 자라거나 약간 염분이 많은 석회질 개울에서 거의 출현할 수 있다².

단색광은 광합성 유기체의 성장과 색소 구성에 영향을 미칩니다., 동굴에서 광합성 유기체의 성장을 방지하거나 제어하기 위해 연구되었습니다. Mulec et al. 적색 농축 조명이 시아노박테리아, 조류 및 식물의 성장을 촉진한다는 것을 보여주었다¹⁶. 이전 연구에서는 녹색광이 시아노박테리아의 색소 조성에 영향을 미친다고 보고한 바 있으며¹⁷, 다른 연구에서는 녹색광이 대부분의 광합성 유기체의 성장을 방해하고 일부 시아노박테리아는 틸라코이드의 감소와 약한 평균 형광 강도를 나타낸다고 보고했다¹⁸.

모델 유기체로서 Chroothece 가 가혹한 조건을 극복하는 능력을 이해하기 위해 배양된 세포는 증가하는 빛의 강도와 단색광(녹색 또는 적색)¹⁵에 노출되어 동굴의 희미한 조건(적색광이 우세함)에 어떻게 대처하는지 확인했습니다. 본원에 제시된 프로토콜은 자체 자가형광을 사용하여 세포 수준에서 Chroothece의 phycobiliproteins에 대한 상기 언급된 변수의 효과를 재현합니다.

오늘날 형광은 혈관 식물, 미세 조류, 거대 조류 및 시아 노 박테리아의 생리적 반응을 연구하는 도구로 일반적으로 사용됩니다^13,14,16. 스펙트럼 컨포칼 형광 현미경은 실험실의 낮은 성장률과 관련된 문제와 관련 추출 및 생화학적 방법을 위한 충분한 바이오매스 확보의 어려움을 방지함으로써 단일 세포 수준 10,17,18,19,20에서 광합성 표본의 생리를 평가하기 위한 생체 내 연구를 위한 탁월한 도구입니다⁸ . 세포가 2주 동안 상이한 배양 조건 하에서 처리되면, 람다 스캔 프로파일은 생체 내에서 측정될 수 있다. 공초점 이미징에 의한 다양한 여기파장^{이 사용된 여러} 논문이 있지만3,4,10,17, 대부분의 피코빌리단백질과 Chla는 561nm 파장 여기선을 사용하여 검출할 수 있으며^, 검출된 방출 범위는 ⁵⁷⁰ 내지 760nm 파장이다. 이러한 기준은 공초점 이미징에 의해 상업적인 순수 안료(표 1)로 이전에 수행된 분석 10과 상이한 조류 종(^20,21,22)에서 얻어진 결과를 기반으로 한다.

안료	λflmax (nm)	λ exc (nm)
		351	364	458	476	488	514	543	633
Chl a	660.9-678.1	43.4 ± 1.8	11.2 ± 0.2	1.8 ± 0.05	2.0 ± 0.08	12.2 ± 0.7	6.0 ± 0.3	4.2 ± 0.16	80.7 ± 1.5
R-PE (알-PE)	569.2-583.3	5.9 ± 0.6	5.9 ± 0.16	11.1 ± 0.04	42.2 ± 0.3	100.0 ± 0	90.0 ± 0.3	99.2 ± 0.08	-
	652.1-668.6	-	-	1.5 ± 0.01	3.7 ± 0.04	26.7 ± 0.5	8.7 ± 0.16	11.1 ± 0.16	11.3 ± 0.2
씨-PC	636.2-676.4	2.3 ± 0.04	1.0 ± 0.01	0.6 ± 0.004	0.7 ± 0.008	2.0 ± 0.08	2.0 ± 0.04	3.3 ± 0.16	33.6 ± 0.9
APC-XL〈블랙〉	667.3-683.8	15.1 ± 1.5	9.6 ± 0.98	1.0 ± 0.04	1.2 ± 0.08	5.9 ± 0.7	4.1 ± 0.5	23.2 ± 3.5	91.4 ± 2.3

표 1: 람다 스캔 분석을 실행하는 데 사용되는 순수 안료 정보. 이 표는 모든 여기 파장에 대한 컨포칼 이미징 분광 광도법에 의한 다양한 형광색소/안료의 발광 피크 및 숄더/형광 대역 최대값과 안료/형광 색소에 의한 발광 비율을 보여줍니다. 값은 공식에 의해 계산되었습니다: = MFI*100/255. 각 값은 평균 ± SE(평균에서 평균 ± 표준 오차)입니다. 순수 안료는 공초점 주사 레이저 현미경의 보정을 위해 하기 ^1,2,10과 같이 사용하였다. 엽록소 a는 Spinacia oleracea에서, R-피코에리트린(R-PE)은 포르피라 테네라에서, C-피코시아닌(C-PE)은 스피룰리나 sp.에서 얻었습니다. 모든 종을 여과된 증류수에 용해시켰다. 알로피코시아닌-XL(APC-XL)은 황산암모늄(60%)과 인산칼륨(pH = 7)에 용해시켜 38mM의 농도를 달성한 Mastigocladus laminosus로부터 얻었습니다. 스캔은 8웰 덮개 유리 바닥 챔버를 사용하여 각 안료 용액(농도 1mg/mL)의 400μL로 수행되었습니다.

단일 여기 파장에 대한 연구는 매우 유용한 첫 번째 근사치입니다. 그러나 이 경우 형광 신호에서 서로 다른 복합체의 상대적 기여도를 설명할 필요가 있으며, 이는 다른 방법 중에서 여러 파장에서 형광 비율 또는 스펙트럼 분석을 수행하는 것이 좋습니다.

프로토콜

조류 종인 Chroothece mobilis가 본 연구에 사용되었습니다. 상기 종은 스페인 미세조류 Edaphic SE, MAESE 20.29 배양물 수집으로부터 입수하였다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

그림 1 : 연구 개요. Chroothece mobilis는 다른 단색 조명과 같은 극한의 서식지 조건에서 2 주 동안 배양됩니다. Chroothece의 생리학에 미치는 영향은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 phycobilisome 및 photosystems에 포함 된 단백질의자가 형광에 의해 평가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 시료 전처리

1. 채취한 한천 배양물로부터 Chroothece mobilis 의 접종물을 SWES 액체 배지로 옮겨 준비한다(표 2).
   참고: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = 해수 배지²³.
2. 원하는 세포 밀도가 얻어질 때까지 모든 배양물을 낮은 백색광 강도(LL: 80μM/m 2/s) 조건 하에서 20°C에서 16:8 명암/어두운 광주기로²주 동안 진탕 없이 유지합니다(단계 1.3 참조).
   참고: 성장 조명 조건은 80 μM/m²/s 광도(활성 광합성 방사선, PAR). 이러한 조건은 저조도 조건(control)으로 사용됩니다. SWES 배지의 조성은 표 2에 제공된다.
3. 웰당 1mL를 사용하여 24웰 플레이트에서 5 x 10³ cells/mL의 세포 밀도로 지수 배양 단계에서 다양한 실험을 위한 접종을 수행합니다.
   참고: Neubauer 챔버²⁴로 세포 계수를 수행하고 필요할 때마다 SWES로 배양물을 희석합니다.

SWES 배지 조성
구성 요소	농도
증권시세 표시기 3	1.98 밀리엠
K2HPO4	115 마이크로미터
마그네슘4	81 마이크로미터
ZnSO4, 7H2O	17 나노미터
망간4, 7H2O	45 Nm 수준
H3BO3, 4H2O	3.1 밀리엠
공동 (아니 3) 2	17 밀리엠
Na2MoO4, 6H2O	21 나노미터
CuSO4, 2H2O	0.1 나노미터
FeSO4, 5H2O	13 마이크로미터
EDTA, 7H2O	11 마이크로미터
빗 B12	5 μg
토양 추출물	30 밀리리터
여과된 강물	455 mL의

표 2: SWES 배지 조성.

2. 극한의 조류 서식지 조건 재현 : 녹색 및 적색 단색 조명 효과

1. 상술한 세포 밀도(단계 1.2)에서 제조된 스톡 배양물로부터 세포 배양액 1 mL를 첨가하여 24-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다.
2. 단색의 조명 효과를 재현하기 위해 세포 배양액을 2주 동안 덮어두십시오.
   1. 506 nm 파장에서 피크를 갖는 470 내지 570 nm에서 녹색 광이 통과할 수 있도록 하는 녹색 필터를 사용하고(제조업자의 사양에 따름; 재료 표 참조) 이를 배양물에 노출시킨다²⁵.
   2. 590 내지 720 nm 사이의 적색광과 678 nm에서의 피크를 허용하는 적색 필터(제조업자의 사양에 따름; 재료 표 참조)를 사용하여 배양물에 노출시킨다²⁵.
      참고: 낮은 백색광 강도(LL: 80μM/m²/s, 재료 표 참조) 조건은 얻은 효과를 비교하기 위한 광도 제어로 사용됩니다. 사용된 광도 단위는 초당 마이크로몰 및 제곱미터(μmol ^{m-2 s-1}) 또는 광합성 광자 플럭스 밀도(PPFD)입니다.

3. 자가형광 이미징

참고: 이미징 소프트웨어의 설정( 재료 표 참조)은 그림 2에 나와 있습니다.

1. 레이저를 포함하여 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM, 재료 표 참조)의 모든 구성 요소를 켭니다.
2. 이미징을 위해 SWES 성장 배지에서 24웰 플레이트의 각 실험 웰의 세포를 35mm 유리 바닥 접시( 재료 표 참조)에 장착합니다.
3. 63x/1.30 NA 글리세롤 이멀젼 대물렌즈를 선택하고 렌즈 위에 글리세롤을 놓습니다( 재료 표 참조).
4. 웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 이미지 획득 중에 표본이 움직이지 않는지 확인합니다.
5. 표본을 빛의 경로 중앙에 놓고 형광 강도가 가장 높은 평면을 선택하여 세포 중심에 초점을 맞춥니다.
6. 이미지 획득 소프트웨어를 열고 획득 모드²⁶의 드롭다운 목록에서 xyλ를 선택합니다.
7. 561nm DPSS, 8비트 다이내믹 레인지 및 1024 x 1024 픽셀에 대한 레이저의 여기 라인을 선택합니다.
   참고: 컨포칼 현미경에 561nm DPSS 레이저 또는 백색광 레이저(WLL)가 있는지 확인합니다.
8. 570-760 nm 범위 내에서 10 nm 대역폭 및 4 nm의 람다 스텝 크기에서 형광 방출 스펙트럼을 수집합니다.
9. 핀홀을 1 Airy 단위로 설정하고 람다 스캔 수집을 실행합니다.
10. 다양한 시야에서 이 과정을 가능한 한 여러 번 반복하여 통계 분석을 위해 허용 가능한 양의 데이터를 수집합니다(일반적으로 표준 편차가 10%²² 미만).
11. 다른 조건(빨간색 및 녹색 표시등 아래)에서 마지막 단계를 반복하고 데이터를 저장합니다.
    참고: 서로 다른 샘플에 대해 동일한 획득 설정을 사용하십시오.amples 및 조건을 비교하여 통계 분석을 수행합니다.

그림 2: 소프트웨어 설정 lambda 스캔 파라미터를 설정하기 위한 이미징 소프트웨어 사용자 인터페이스. (A) 왼쪽에서 오른쪽으로, 드롭 다운 목록에서 프로토콜의 3.6 단계에 해당하는 획득 모드 xyλ를 선택하고, 프로토콜의 3.3 단계에 해당하는 오른쪽 침수 렌즈 유형을 선택합니다. 3.9단계에서 조명 경로에서 필터를 제거해야 합니다. (B) 람다 스캔 파라미터를 설정하기 위한 패널은 프로토콜의 3.8단계에 해당합니다. (C) 3.10단계에서 람다 스캔을 실행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. Chroothece의 생리학을 평가하기 위한 매개변수

1. 람다 스캔이 수집되면 소프트웨어 상단의 정량화 창( 그림 3 참조)을 클릭하여 수집된 형광 방출 스펙트럼을 평가합니다. 프로젝트 열기 창으로 이동하여 xyλ 파일 하나를 선택합니다(그림 3).
2. 이미징 소프트웨어에서 스택 프로파일 분석을 선택합니다.
3. 평균 형광 강도(MFI)를 분석하기 위해 세포 중앙에^4μm2 의 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 데이터를 CSV 형식으로 내보냅니다.
   참고: 검은색 픽셀의 존재를 피하고(선택한 픽셀에 양수 값이 포함되도록 하기 위해) 항상 동일한 크기의 ROI를 유지하는 것이 중요합니다.
4. 서로 다른 조건에서 서로 다른 셀에 대해 이 과정을 반복하여 통계 분석을 수행하기에 충분한 데이터를 생성합니다.
5. CSV 파일을 열어 측정된 모든 ROI의 phycobiliproteins 및 엽록소에서 다양한 형광 방출 피크를 선택합니다.
   1. csv 파일에서 phycoerythrin-phycocyanobilin(PE-PCB; 620 nm), C-phycocyanin(CPC; 648 nm), allophycocyanin(APC; 660 nm) 및 chlorophyll a(Chl a; 680 nm)의 형광 데이터를 각각 선택합니다.
6. 각 phycobiliprotein 및 엽록소 피크에서 얻은 모든 최대 형광 값이 포함된 새 표를 만들고 데이터를 그래프에 표시합니다.
7. 통계 분석을 수행합니다.
   1. 얻어진 데이터가 정규성과 동질성을 충족하는지 분석²⁷.
   2. 첫 번째 조건이 참인 경우 t-검정 분석^27,28로 진행합니다. 그렇지 않은 경우 Mann-Whitney U 테스트²⁹를 실행합니다.
   3. p 값 <0.05에서 유의한 차이를 고려하십시오.

그림 3: Chroothece의 자가형광 평가. 자가형광 분석을 수행하려면 열린 프로젝트 창에서 정량화 창과 하나의 xyλ 파일을 선택해야 합니다(4.1단계). 스택 프로파일 시각화를 선택하십시오 (4.2 단계). 셀 중앙에서^4μm2 ROI를 선택하고 보고서 버튼을 클릭하여 Lambda 스캔 데이터를 CSV 형식으로 내보냅니다(4.3단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

엽록소 a는 일반적으로 가시광선의 청색과 적색 파장을 흡수하는 반면, 피코빌리단백질은 녹색, 황색, 주황색 파장을 사용한다⁷. 이러한 색소의 자가형광은 실험 및 현장 조건에서 phycobiliproteins 및 엽록소 거동을 연구하는 첫 번째 접근 방식을 가능하게 합니다.

얻은 데이터를 비교하고 다른 그래프에 플로팅하면 평균 형광 강도(MFI)의 유의미한 변화를 구별할 수 있습니다(그림 4). 람다 스캔 프로파일(620, 648, 660 및 680nm)에서 얻은 다양한 방출 피크에 대한 은밀한 통계 연구는 상당한 차이를 보여주었습니다(통계적 유의성: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

PE-PCB의 MFI는 세포가 녹색 단색광(GL)에 노출...

토론

Chroothece와 같은 일부 단세포 또는 식민지 홍조류는 시험관 내에서 천천히 성장하지만 안료 방출 피크의 차이를 감지할 수 있는 컨포칼 현미경 하에서 스펙트럼 분석으로 분석할 수 있는 여러 자가형광 화합물을 포함합니다. 스펙트럼 공초점 형광 현미경을 통해 광합성 유기체 8,10,17,18,19,20의 적응 또는 순응을 평가하기 위한 생체 내 연구를 수행할 수 있었습니다. 단백질 분석과 같은 대부분의 다른 기술은 많은 양의 샘플이 필요하거나 파괴적이거나 훨씬 더 비쌉니다.

561...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
&마이크로;-접시 35mm, 높은 유리 바닥	Ibidi	81158-24
블랙 웰 플레이트	Ibidi	82406	고처리량 현미경 검사를 위한 평평하고 투명한 바닥
조류 인큐베이터	Panasonic	MLR-352-PE
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Leica Microsystems	SP8 TCS-Flask
	Fisher Scientific	15380591	지역 편의점이나 온라인 상점에서 구입할 수 있습니다.
그린 필터	PNTA, LEE 필터	-	지역 편의점이나 온라인 스토어에서 구입할 수 있습니다.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	글리세롤 이멀젼 렌즈
이미지 획득 소프트웨어. LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS-Light
source	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
양자 광복사계	DeltaOhm	DO 9721-R
소프트웨어	R Core Team, 2020	4.0.2.	-
레드 필터	PNTA, LEE 필터	-	지역 편의점이나 온라인 스토어에서 구입할 수 있습니다.
SWES 매체	무르시아 대학교	-	-
타입 G 침수 액체	Leica Microsystems	11513910	글리세롤