인간 진균 병원체인 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 숙주 내에서 생존을 촉진하기 위해 다양한 독성 인자(예: 펩티다아제)를 생성합니다. 환경적 틈새는 새로운 천연 펩티다아제 억제제의 유망한 공급원입니다. 이 프로토콜은 연체 동물 추출물의 준비와 곰팡이 독성 인자 생산에 미치는 영향에 대한 평가를 간략하게 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 캡슐화된 인간 진균 병원체로 전 세계적으로 분포하여 주로 면역 저하 개체를 감염시킵니다. 임상 환경에서 항진균제의 광범위한 사용, 농업에서의 사용 및 균주 교잡은 내성의 진화를 증가시켰습니다. 항진균제에 대한 내성 증가율은 전 세계 임상의와 과학자들 사이에서 우려가 커지고 있으며 새로운 항진균 요법 개발의 시급성이 높아지고 있습니다. 예를 들어, C. neoformans 는 조직 분해, 세포 조절 및 영양소 획득에 역할을 하는 세포내 및 세포외 효소(예: 펩티다아제)를 포함한 여러 독성 인자를 생성합니다. 억제제에 의한 이러한 펩티다아제 활성의 중단은 곰팡이의 성장과 증식을 교란시켜 이것이 병원체 퇴치를 위한 중요한 전략이 될 수 있음을 시사합니다. 중요한 것은 연체 동물과 같은 무척추 동물이 생물 의학 응용 및 항균 활성을 가진 펩티다제 억제제를 생산하지만 곰팡이 병원체에 대한 사용 측면에서 충분히 연구되지 않았다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 연체동물에서 글로벌 추출을 수행하여 조잡하고 정제된 추출물에서 잠재적인 펩티다제 억제제를 분리하고 고전적인 크립토코커스 독성 인자에 대한 효과를 평가했습니다. 이 방법은 항진균 특성을 가진 연체동물의 우선 순위를 지원하고 연체동물에서 발견되는 천연 억제제를 활용하여 항독성제를 발견할 수 있는 기회를 제공합니다.
서론
크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)는 HIV/AIDS 보균자와 같은 면역 저하 숙주에서 심각한 질병을 일으키는 인간 진균 병원체이며1, AIDS 관련 사망의 약 19%를 차지한다2. 곰팡이는 아졸, 폴리엔 및 플루시토신을 포함한 여러 종류의 항진균제에 취약하며, 이는 뚜렷한 메커니즘을 사용하여 살균 및 살균 활성을 발휘합니다 3,4. 그러나 임상 및 농업 환경에서 항진균제의 광범위한 사용과 균주 교잡은 C. neoformans5를 포함한 여러 곰팡이 종에서 내성의 진화를 증폭시켰다.
항진균 내성 문제를 극복하고 전 세계적으로 진균 감염의 유병률을 줄이기 위해, 유망한 접근법은 크립토코커스 종의 독성 인자(예: 온도 적응성, 다당류 캡슐, 멜라닌 및 세포외 효소)를 잠재적인 치료 표적으로 사용하는 것이다 4,6
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프로토콜
1. 연체 동물에서 단백질 추출
- 지정되고 승인된 자연 지역(예: Speed River, Guelph, Ontario)에서 연체동물을 수집합니다. 이 연구에서는 광범위한 잠재적 항진균 효과를 평가하기 위해 토착 종과 침입 종을 모두 선택했습니다.
- 유봉과 절구를 사용하여 연체 동물 (예 : Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi 및 Cipangopaludina chinensis)의 껍질을 부드럽게 부수고 핀셋으로 단단한 조각을 제거합니다. 일반적으로 프로토콜 전체에서 사용하기 위해 10개의 연체동물이 풀링됩니다.
- 장기를 수집하고 무게를 잰다. 약 15-20g의 샘플이 최적입니다. 가위를 사용하여 장기를 약 0.5-1cm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
- 해부된 장기 샘플을 급속 동결하고 액체 질소로 절단합니다. 그런 다음 유봉과 박격포를 사용하여 장기 샘플을 미세한 분말로 분쇄합니다.
- 장기 샘플 분말(약 15g)을 차가운 증류수(4°C) 30mL에 넣어 1:2 비율(w/v)을 얻습니다.
- 시료 2mL를 고충격 2mL 튜브에 붓습니다. 3mm 스테인리스 스틸 비드(약 500μg)를 각 튜....
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결과
본원에 기술된 워크플로우는 C. neoformans에 대한 잠재적인 항독성 특성을 갖는 연체동물로부터 단백질 및 펩티드의 분리를 가능하게 한다. 유사하게, 다양한 형태의 추출물(즉, 원유 및 정제)을 평가하면 잠재적인 활성 화합물의 반정제가 가능하고 다운스트림 평가(예: 질량 분석 기반 단백질체학)를 지원합니다. 일반적으로 단백질 추출 워크플로우는 단백질 농도가 4-8mg/mL인 균질화된 용액을 생성합니다. 여기에서 대표적인 결과는 C. chinensis 추출물의 효소 활성 및 항진균 특성의 평가를 보여줍니다. 조잡하고 정제된 추출물은 서브틸리신 A(C. neoformans의 독성과 관련됨)(그림 3)의 단백질 분해 활성을 억제할 수 있었으며, IC 50 값은 각각 5.3μg/mL 및 4.53μg/mL였습니다. C. chinensis 추출물의 활성은 곰팡이 성장, 캡슐 및 멜라.......
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토론
여기에 설명된 추출 프로토콜은 캐나다 온타리오에서 수집한 연체동물에서 화합물을 분리하는 방법을 설명하고 인간 진균 병원체인 C. neoformans에 대한 연체동물 추출물 사용에 대한 새로운 조사를 보여줍니다. 이 프로토콜은 무척추동물의 펩티다아제 억제제 활성을 조사하는 연구의 증가에 추가된다13. 추출하는 동안 일부 추출물 샘플은 필터 멤브레인을 막는 가용성 다당류 및/또는 안료의 존재로 인해 필터 멸균이 어려웠습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 먼저 5μm 멤브레인을 통해 필터링하여 큰 화합물(예: 파괴된 세포막, 게놈 DNA)을 배제하여 단백질이 필터를 통과하도록 한 다음 0.22μm 멤브레인을 통해 다시 필터링하는 것이 좋습니다. 이러한 단계는 샘플을 오염시키고 다운스트림 실험을 방해할 수 있는 미생물의 존재를 제한하기 때문에 프로토콜에 매우 중요합니다.
이 조사 동안, 펩티다아제 억제제는 서브틸리신의 S8 계열.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 이 조사와 원고 피드백 전반에 걸쳐 귀중한 지원을 해준 Geddes-McAlister Lab 회원들에게 감사를 표합니다. 저자는 온타리오 대학원 장학금 및 국제 대학원 연구상 - University of Guelph에서 D.G.-G까지, 캐나다 혁신 재단(JELF 38798) 및 온타리오 대학 및 대학부 - J.G.-M에 대한 조기 연구원 상.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 &무; m Filters | VWR | 28145-477 (북미) | |
| 1.5 mL 튜브 (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL 튜브 (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| 원심분리기 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | 사용할 수 | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC 현미경 | 올림푸스 | ||
| DIC 현미경 소프트웨어 | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| 포도당(D-포도당, 무수, 시약 등급) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| 글리신 | 피셔 화학 | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad 프리즘 9 | Dotmatics | ||
| 혈구계 | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| 인산염 완충염 pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not | |
| available Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | 시그마 알드리치 | P4860 | CAS # : 9014-01-01 |
| 숙시닐 알라 알라 프로 페 - p- 니트로 아닐라이드 | 시그마 알드리치 | 573462 | CAS # # : 70967-97-4 |
| 열욕 | VWR | 76308-834 | |
| 티아민 염산염 | 피셔 - 생물 시약 | BP892-100 | CAS # : 67-03-8 |
| 효모 추출물 | BioShop | YEX401 | CAS # : 8013-01-2 |
| 효모 질소 베이스 (아미노산 포함) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
참고문헌
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adu....
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재인쇄 및 허가
