소핵(MN) 분석은 DNA 손상을 정량화하기 위한 잘 확립된 검사입니다. 그러나 수동 현미경 또는 특징 기반 이미지 분석과 같은 기존 기술을 사용하여 분석에 점수를 매기는 것은 힘들고 어렵습니다. 이 논문은 이미징 유세포 분석 데이터를 사용하여 MN 분석의 점수를 매기는 인공 지능 모델을 개발하는 방법론을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
소핵(MN) 분석은 유전 독성에 대한 화학 물질을 평가하기 위해 전 세계적으로 규제 기관에서 사용됩니다. 분석은 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 한 번 분할된 사이토카인시스 차단 이핵세포 또는 완전히 분할된 단핵구 세포에서 MN을 채점합니다. 역사적으로 광학 현미경은 분석에 점수를 매기는 황금 표준 방법이었지만 힘들고 주관적입니다. 유세포 분석은 최근 몇 년 동안 분석의 점수를 매기기 위해 사용되었지만 세포 이미지의 주요 측면을 시각적으로 확인할 수 없기 때문에 제한적입니다. 이미징 유세포 분석(IFC)은 고처리량 이미지 캡처와 자동화된 이미지 분석을 결합하며, MN 분석에서 모든 주요 이벤트의 이미지를 빠르게 획득하고 점수를 매기는 데 성공적으로 적용되었습니다. 최근에는 컨볼루션 신경망을 기반으로 하는 인공 지능(AI) 방법을 사용하여 IFC에서 획득한 MN 분석 데이터의 점수를 매길 수 있음이 입증되었습니다. 이 백서에서는 AI 소프트웨어를 사용하여 딥 러닝 모델을 만들어 모든 주요 이벤트에 점수를 매기고 이 모델을 적용하여 추가 데이터에 자동으로 점수를 매기는 모든 단계를 설명합니다. AI 딥 러닝 모델의 결과는 수동 현미경과 잘 비교되므로 IFC와 AI를 결합하여 MN 분석의 완전 자동 스코어링이 가능합니다.
서론
소핵(micronucleus, MN) 분석은 인체용 화장품, 의약품 및 화학물질 개발에서 DNA 손상을 평가하기 위한 유전독성학의 기본이다 1,2,3,4. 소핵은 분열 후 핵에 통합되지 않고 핵과 분리된 작은 원형체로 응축되는 전체 염색체 또는 염색체 조각으로 형성됩니다. 따라서, MN은 유전독성 시험1에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 종말점으로 사용될 수 있다.
MN을 정량화하는 데 선호되는 방법은 Cyt-B(Cyt-B)를 사용하여 분열을 차단하여 일회성 분열 이핵 세포(BNC) 내에서 하는 것입니다. 이 버전의 분석에서 세포 독성은 단핵구(MONO) 및 다핵구(POLY) 세포의 점수를 매겨 평가됩니다. 이 분석은 또한 증식을 평가하기 위해 노출 전 및 노출 후 세포 수를 사용하여 세포 독성을 평가하여 더 빠르고 쉽게 점수를 매길 수 있는 차단되지 않은 MONO 세포에서 MN을 채점하여 수행할 수 있습니다 5,6
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프로토콜
1. 이미징 유세포 분석을 이용한 데이터 수집
참고: 최적의 이미지 캡처를 위해 IFC를 사용하는 획득 영역을 수정해야 할 수도 있다는 점에 유의하여 다음과 같이 수정한 Rodrigues et al.16 을 참조하십시오.
- non-Cyt-B 방법의 경우, 배양 직전 및 회수 기간 직후의 각 배양물에 대해 제조업체의 지침( 재료 표 참조)에 따라 시판되는 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 수행합니다.
- 단일 카메라 이미징 유세포분석기에서 샘플을 실행하는 경우 명시야(BF)를 채널 4에 배치합니다. M01을 M04로, M07을 M01로 바꿉니다.
알림: "M"은 IFC의 카메라 채널을 나타냅니다. - 획득 중에 40x 배율을 사용합니다.
- 획득 중 BF 영역 대 BF 종횡비 플롯에서 다음 영역 좌표를 사용합니다.
X 좌표 : 100 및 900; Y 좌표: 0.7 및 1(Cyt-B 방법)
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결과
그림 1은 AI 소프트웨어를 사용하여 MN 분석을 위한 모델을 생성하는 워크플로우를 보여줍니다. 사용자는 원하는 .daf 파일을 AI 소프트웨어에 로드한 다음 AI 지원 클러스터(그림 2) 및 예측(그림 3) 태깅 알고리즘을 사용하여 실측 자료 모델 클래스에 객체를 할당합니다. 모든 실측 모델 클래스가 충분한 객체로 채워지면 RF 또는 CNN 알고리즘을 사용하여 모델을 훈련할 수 있습니다. 훈련 후에는 클래스 분포 히스토그램, 정확도 통계 및 대화형 혼동 행렬을 포함한 도구를 사용하여 모델의 성능을 평가할 수 있습니다(그림 4). AI 소프트웨어의 결과 화면에서 사용자는 워크플로의 훈련 부분으로 돌아가 실측 데이터를 향상시키거나, 충분한 정확도가 달성된 경우 모델을 사용하여 추가 데이터를 분류할 수 있습니다.
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토론
여기에 제시된 작업은 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 MN 분석의 스코어링을 자동화하는 방법을 설명합니다. 몇몇 최근의 간행물들은 직관적이고, 상호작용적인 도구들이 심층적인 계산 지식(18,19)에 대한 필요 없이 이미지 데이터를 분석하기 위한 딥 러닝 모델들의 생성들을 허용한다는 것을 보여주었다. 사용자 인터페이스 기반 소프트웨어 패키지를 사용하여 이 작업에서 설명하는 프로토콜은 매우 큰 데이터 파일에서 잘 작동하고 딥 러닝 모델을 쉽게 생성할 수 있도록 설계되었습니다. AI 소프트웨어 패키지에서 RF 및 CNN 모델을 생성하고 훈련하는 데 필요한 모든 단계에 대해 설명하여 Cyt-B 및 non-Cyt-B 버전의 분석에서 모든 주요 이벤트를 매우 정확하게 식별하고 정량화할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 딥 러닝 모델을 사용하여 추가 데이터를 분류하고 화학적 세포 독성 및 MN 빈도를 평가하는 단계를 설명합니다.
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공개 사항
저자는 DiaSorin Company인 Luminex Corporation, ImageStream 이미징 유세포 분석기 및 이 작업에 사용된 Amnis AI 소프트웨어 제조업체에 고용되어 있습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Falcon | 352096 | |
| 클렌저 - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | 200 mL의 클렌저로 용기를 채우십시오. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning 병탑 진공 필터 | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 &마이크로; m 필터, 500 mL 병 |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg 병 |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | 200 mL의 Debubbler로 용기를 채웁니다. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ 무료 |
| 소 태아 세럼 | HyClone | SH30071.03 | |
| 포름알데히드, 10%, 메탄올 무함유, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | 이것은 4% 및 1% 포르말린에 사용되는 것입니다. 주의: 포르말린/포름알데히드는 흡입 및 삼키면 독성이 있습니다. 눈, 호흡기 및 피부에 자극적입니다. 흡입 또는 피부 접촉에 의해 과민반응을 일으킬 수 있음. 눈에 심각한 손상의 위험이 있습니다. 잠재적인 암 위험. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | 표준 구성 Guava Muse Cell Analyzer를 사용했습니다. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL 용액 |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II 405 nm, 488 nm 및 642 nm 레이저로 제어되었습니다. |
| MIFC 분석 소프트웨어 - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC 소프트웨어 - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that running the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI 소프트웨어" 이것은 데이터를 분석하기 위한 인공 지능 모델의 생성을 허용하는 소프트웨어입니다 |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100X | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| 린스 - 초순수 또는 탈이온수 | NA | 초순수 또는 탈이온수를 사용하십시오. 용기에 헹굼 900mL를 채웁니다. | |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 중간 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| 칼집 - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | 이것은 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x와 동일합니다 Ca++MG++ 무료. 용기에 칼집 900mL를 채웁니다. |
| 멸균수 | HyClone | SH30529.01 | |
| 살균기 - 0.4%– 0.7% 하이포클로산라이트 | VWR | JT9416-1 | 이것은 당연히 10% 클로록스 표백제로, 클로록스 표백제를 물로 희석하여 만들 수 있습니다. 용기에 200mL의 멸균제를 채웁니다. |
| T25 플라스크 | 팔콘 | 353109 | |
| T75 플라스크 | 팔콘 | 353136 | |
| TK6 세포 | MilliporeSigma | 95111735 |
참고문헌
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cel....
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재인쇄 및 허가
