부분 좌골 신경 결찰: 새로운 치료법의 항통각수용 효과를 연구하기 위한 만성 신경병성 통증의 마우스 모델

만성 통증은 전 세계적으로 중요한 의료 문제이며 미국에서 가장 비용이 많이 드는 건강 문제 중 하나입니다. 만성 통증은 약리학적 양식과 비약리학적 양식이 다학제적 방식으로 활용될 때 더 잘 관리된다¹. 만성 통증의 관리는 어렵고, 어떤 경우에는 통증을 적절하게 치료하지 못한다². 따라서 만성 통증 관리를 개선하기 위해서는 새롭고 보완적인 방법이 필요하며 동물 모델은 혁신적인 치료법을 조사하는 데 중요합니다.

만성 신경병증성 통증은 당뇨병, 감염, 신경 압박 또는 자가면역 질환을 포함한 체감각계의 병변 또는 질병으로 인해 발생합니다³. 신경병성 통증은 말초 및 중추 감작 메커니즘에 의존하며 신경의 병변에서 비롯됩니다. 이 통증은 촉각 및 열 유발 통각과민과 이질통, 지속적인 통증, 영향을 받은 사지의 온도 변화 등을 특징으로 할 수 있다⁴. 기전을 더 잘 이해하고 새로운 치료법을 발전시키기 위해, 설치류에서 신경병증성 통증의 증상과 원인을 모방하는 몇 가지 모델이 개발되었다⁵. 예를 들어, 신경병증성 통증은 화학요법제 주사, 척추 신경 결찰술 (SNL), 좌골 신경의 만성 수축 손상 (CCI), pSNL, 보존된 신경 손상, 좌골 신경 절제술 및 좌골 신경 삼부로 유도될 수 있다⁶. 특히, 좌골 신경의 결찰은 기계적 및 열적 과민증 또는 복합 부위 통증 증후군(CRPS^)의 특징인 영향을 받은 사지의 온도 변화와 같이 인간에서 관찰되는 신경병성 통증의 여러 특징을 재현합니다7. 따라서, 이 모델은 만성 신경병증성 통증을 유도하는 CRPS 또는 임의의 다른 신경 손상 애정의 연구에 매우 적합하다. 이 모델은 1990 년 Seltzer에 의해 처음 개발되었으며 8, 새로운 진통제 화합물을 조사하거나 만성 통증의 인지 효과를 평가하기 위해 통증 연구에서 널리 사용됩니다^{9,10,11,12,13}. 이 모델은 높은 재현성을 나타내며 부분 결찰은 말초 자극에 대한 행동 반응을 보존합니다⁶.

현재 사용되고 있는 모델 중 상당수는 pSNL에서 관찰되지 않는 단점을 가지고 있습니다. CCI 모델은 수축기의 아늑함에 따라 각 동물 간의 손상 변동성이 훨씬 더 높으며, 자가절제술은 뒷발을 변경하여 모델을 행동 분석에 부적합하게 만든다⁶. SNL 모델은 훨씬 더 복잡하고 긴 수술로 고급 기술이 필요할 뿐만 아니라 심각한 운동 장애의 위험이 높습니다³. 이러한 단점은 pSNL 모델에서는 볼 수 없습니다. 재현성의 용이성, 짧은 수술 기간, 수술 후 나타나는 운동 결손의 위험 감소로 인해 이 모델은 말초 신경병성 통증을 연구하는 데 유용합니다 ^8,14. 그럼에도 불구하고, 부분 결찰 절차 자체는 실험자들 사이에서 가변성을 가질 수 있으며, 그 결과 결찰된 신경 섬유의 수의 일관성이 떨어질 수 있습니다. 따라서 수술의 세부 사항을 제시하는 것은 연구 간의 재현성을 높이는 데 중요합니다.

만성 신경병증을 유도하기 위해 9-0 비흡수성 나일론 봉합사를 사용하여 좌골 신경 너비의 1/3을 결찰합니다. 수술 후 열 및 기계적 자극에 대한 반응이 과장되어 수술 후 1일째부터 시작하여 50일 이상 지속된다⁸. 여기에서 Hargreaves, hot plate 및 von Frey 필라멘트 테스트를 사용하여 28일 동안 열적 및 기계적 감도를 평가했습니다. 모든 행동 분석은 오래 지속되는 과민증의 일관성을 입증했습니다. 이 모델은 모르핀과 이부프로펜 모두의 용량 의존적 효과가 있는 것으로 나타났으며, 이는 전임상 통증 연구에 매우 적합함을 확인시켜줍니다. 특히, 이 기사에서는 "신경 유리 후크"라고 하는 고유한 수제 유리 도구에 대한 지침을 설명합니다. 이 도구는 관자 대신 신경을 조작하고 수술 중 의도하지 않은 추가 신경 손상을 방지하는 데 사용됩니다.

모든 절차는 애리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원의 실험 동물 사용 지침(NIH 간행물 번호 80-23, 1966)을 준수합니다. 병원체가 없는 성체 C57Bl6/J 마우스(테스트 시 무게: 22-28g)는 12시간 명암 주기로 기후 조절실의 표준 동물 사육장 마우스 케이지(케이지당 5마리)에 수용되었으며 음식과 물에 임의로 접근할 수 있었습니다. 모든 행동 실험은 치료 조건에 눈이 먼 실험자에 의해 수행되었습니다.

1. 기준선: 기계적 감도 측정

1. 생쥐가 도착하면 1 주일 동안 동물 시설에 익숙해 지도록하십시오. 이어서, 그 후 ≥7일 동안 실험자 취급에 동물을 습관화시킨다.
2. 마우스를 시험실과 같은 방에서 철망 위의 투명한 플렉시글라스 상자에 넣어 시험하기 전에 1시간 동안 von Frey 시험 장치에 습관화합니다.
3. 3.61(3.9mN) 필라멘트로 시작하여 보충 표 S1에 설명된 von Frey 필라멘트를 사용하여 "상하" 방법을 통해 기준선 발 인출 임계값을 설정합니다.
   1. 일련의 보정된 미세(von Frey) 모노필라멘트로 중간 발바닥 뒷발을 조사할 때의 금단 반응을 측정합니다. 매달린 철망 케이지에 보관된 동물의 pSNL 동측 뒷발의 발바닥 표면에 각 필라멘트를 수직으로 한 번 적용합니다. "up-and-down" 방법을 사용하여 기계적 감도 평가¹⁵: 필라멘트의 크기에 해당하는 자극 강도를 순차적으로 증가시키거나 감소시켜 인출 역치를 결정한다. 각 필라멘트를 순차적으로 한 번 도포합니다.
      알림: 실험자는 동물 간에 일관된 결과를 얻기 위해 발판을 자극하지 않아야 합니다.
   2. 예를 들어, 동물이 3.61 필라멘트에 반응하지 않으면 더 두꺼운 4.08 필라멘트 (9.8 mN)를 사용하십시오 (반응은 영향을받는 발의 철수, 흔들림 또는 핥기로 시각적으로 표시됨). 동물이 처음 반응하면 더 얇은 3.22 (1.6 mN) 필라멘트를 사용하십시오. 동물이 각각 긍정적 또는 부정적 후속 반응을 보였는지 여부에 따라 점점 더 두꺼운 필라멘트를 계속 사용하십시오. 보충 표 S1에 제시된 데이터시트에 부정적인 반응과 긍정적인 반응을 보고합니다. 첫 번째 양성 반응 후 다른 필라멘트로 동일한 발을 4x 테스트합니다.

2. 기준선: Hargreaves 테스트를 사용한 열 감도 측정

1. 생쥐가 도착하면 1 주일 동안 동물 시설에 익숙해 지도록하십시오. 이어서, 그 후 ≥7일 동안 실험자 취급에 동물을 습관화시킨다.
2. 마우스를 시험실과 같은 방에서 투명한 플렉시글라스 상자에 넣어 시험하기 전에 1시간 동안 Hargreaves 시험 장치에 습관화시킵니다.
   참고: Hargreaves 테스트에서는 동물이 몇 초 동안 가만히 서 있어야 합니다. 생쥐의 경우 습관화는 성공적인 실험의 핵심입니다. 따라서 생쥐가 1 시간의 습관화 후에도 매우 활동적이라면 필요에 따라 더 오래 적응할 수 있습니다.
   1. Hargreaves et ^al.16에 의해 설명된 대로 발 철수 대기 시간을 결정합니다. Plexiglas 인클로저 내의 마우스를 투명한 Plexiglass 플레이트에 적응시킵니다.
   2. 복사열원(고강도 프로젝터 램프)을 pSNL과 동측인 뒷발의 발바닥 표면에 집중시킵니다. 열원의 강도를 조정하여 약 10초의 발 철수 대기 시간의 기준선을 얻습니다. 그런 다음 실험의 나머지 기간 동안 강도를 일정하게 유지합니다.
   3. 발을 뺄 때 동작 감지기가 자극과 타이머를 자동으로 중지할 때까지 기다립니다. 조직 손상을 방지하기 위해 최대 33.5초의 컷오프를 사용하십시오.
      참고: 컷오프는 추가 피부 손상^11,17,18을 방지하기 위해 이전 실험 및 기사를 기반으로 결정됩니다. 이 연구에 사용된 강도에서 33.5는 컷오프이며, Hargreaves 장치를 사용한 자극 강도 30(50W)에 해당합니다. 관찰 된 행동은 자발적인 행동이 아니라 반사적 인 행동입니다.
   4. Hargreaves 장치를 사용하고 pSNL 동측 뒷발의 발바닥 표면을 목표로 하여 기준선 발 철수 대기 시간을 설정합니다. 열 자극을 시작하고 금단 대기 시간을 기록합니다. 열 자극의 온도에 영향을 미치지 않으려면 시험 중에 소변을 청소하십시오.

3. 기준선 : 열판 테스트를 이용한 열감도 측정

1. 실험 전에 1시간 동안 동물을 시험실에 습관화시킵니다.
   알림: 실내 온도가 중요하고 열판 테스트에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 습관화 기간과 테스트 기간 동안 실내 온도가 지속적으로 약 22°C인지 확인하십시오.
2. 열판을 52°C로 설정하면, 이 온도는 이상적으로 혐오적인 열 반응을 이끌어내는 것으로 나타났기 때문이다¹⁹.
3. 동물을 실험실에 넣고 크로노 미터를 시작하십시오.
4. 통각 행동(예: 발 철수, 핥기, 흔들기)을 관찰합니다. pSNL 수술은 뒷다리에 영향을 미치므로 앞다리에서 관찰되는 모든 행동(특히 앞다리 핥기)은 무시하십시오.
5. 통각 행위가 관찰되는 즉시 크로노미터를 중지하십시오.
6. 챔버에서 동물을 제거하고이 행동에 대한 대기 시간을 기록하십시오.
   알림: 조직 손상을 방지하기 위해 최대 30초 후에 챔버에서 동물을 제거합니다. 또한 관찰된 행동은 자발적인 행동이 아니라 반사적인 행동이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
7. 냄새의 행동 영향을 줄이기 위해 동물 사이에 70% 에탄올로 테스트 챔버를 청소하십시오. 열 자극의 온도에 영향을 미치지 않도록하려면 테스트 된 각 동물 사이의 소변 장치를 청소하십시오.
8. 결과를 확인하려면 동물 테스트 후 검토를 위해 테스트 중 핫 플레이트 챔버에 있는 동물의 비디오를 녹화합니다.
   참고: 비디오 검토를 사용하여 대기 시간을 정량화함으로써 실험자는 테스트를 반복적으로 관찰하고 실시간 관찰 중에 놓쳤을 수 있는 통각 행동을 면밀히 분석할 수 있습니다.

4. 수술 전 준비

알림: 수술 후 마우스를 회수하기 위해 깨끗한 케이지를 사용할 수 있는지 확인하십시오. 70 % 에탄올로 수술 부위를 청소하고, 70 % 에탄올로 손을 소독하고, 멸균 장갑을 사용하고, 적절한 개인 보호 장비 (PPE) (실험실 코트, 헤어 네트, 신발 커버)를 착용하고, 수술 내내 멸균 기술을 연습하십시오.

1. 수술에 사용할 도구(보충 그림 S1)와 추가 리소스(거즈)를 미리 고압증기멸균하여 준비합니다.
2. 휘발성 이소플루란을 사용하여 마취를 유도하고 수술 평면을 유지하기 위해 필요에 따라 조정합니다. 산소가 적절한 유속인지 확인하십시오.
3. 동물이 마취되었는지 확인하려면 핀셋으로 뒷발의 발가락을 꼬집어 발 반사가 없는지 확인하고 윤활 안과 연고를 바르기 전에 각막 깜박임 반사를 확인하십시오.
   참고: 진통제는 분석하려는 통증 경로를 변경하거나 통증 연구 목표^20,21,22에 따라 측정되는 행동을 중화 및 무효화할 수 있으므로 이 연구에서 제공할 수 없습니다.
4. 수술을 수행 할 쪽을 선택하면 (왼쪽은 여기에 시연 됨) 동물의 뒷다리를 허벅지 주위, 슬개골 쪽쪽으로, 엉덩이쪽으로 위쪽으로, 대퇴골 위로 면도합니다. 따뜻한 멸균 식염수로 번갈아 가며 3 개의 분리 된 거즈로 한 방향으로 클로르헥시딘으로 3 번 닦아냅니다.
   알림: 앞으로 일관성을 유지하기 위해 모든 동물이 같은 쪽에서 수술을 받았는지 확인하십시오.
5. 10cm x 10cm 멸균 드레이프로 만든 슬릿을 통해 다리를 밀어 넣어 선택한 다리 주위에 멸균 필드를 만듭니다.

5. 수술 절차

1. 미세 수술용 가위(보충 그림 S1F)를 사용하여 허벅지 측면의 정중선에서 피부를 2mm 작게 자릅니다. 가위를 피부 아래로 원을 그리며 밀어 근막을 뚫고 틈을 만들어 절개 공간을 넓힙니다.
2. 묶는 집게(보충 그림 S1H)를 사용하여 허벅지 근육을 90cm 깊이의 1° 각도로 수직으로 날카로운 절개를 만듭니다.
3. 가는 작은 가위(보충 그림 S1G)를 같은 절개 부위에 90° 각도로 삽입하고 부드럽게 벌려 근육을 분리합니다. 좌골 신경이 시각화 될 때까지 계속하십시오.
4. 엉덩이에서 무릎 방향으로 수직 허벅지와 평행하게 뻗어 있고 광택이 있고 얇아 보일 수 있는 좌골 신경을 찾습니다. 계속하기 전에 몸에서 가위와 묶는 집게를 제거하십시오.
5. 초미세 집게(보충 그림 S1D)와 신경 유리 고리(보충 그림 S1E)를 사용하여 신경을 아래에서 분리합니다. 엉덩이에 가장 가깝고 무릎에서 가장 먼 대퇴골 기병 근처의 부위에서 주변 결합 조직에서 신경을 조심스럽게 제거합니다.
6. 신경이 유리 막대에 놓이도록 하고 막대 끝이 신경이 굴러가는 것을 방지하는지 확인합니다.
7. 좌골 신경 너비의 1/3을 9-0 나일론 봉합사를 사용하여 묶기 전에 수술 매듭을 놓고 총비골, 경골 및 비복 신경 가지로 나눕니다³.
   참고: 분기는 좌골 신경이 엉덩이에서 멀어지면서 무릎 아래로 흐를 때 발생합니다. 신경의 이 세 가지 가지에는 세 가지 다른 신경 분포가 있기 때문에 모든 동물 수술에서 동일한 신경 결손이 있는지 확인하기 위해 분기 전에 수술 매듭을 배치하는 것이 필수적입니다.
8. 실을 꽉 당길 때 실을 매듭에 가깝게 잡고 과도한 힘으로 신경을 잡아 당기지 않도록 주의하여 신경이 유리 막대에서 미끄러지는 것을 방지하고 더 이상의 스트레칭 부상을 방지하십시오.
9. 매듭이 완성되면 유리 막대에서 신경을 조심스럽게 빼내고 분리된 근육 아래 수준의 원래 위치로 다시 밀어 넣습니다.
10. 흡수성 폴리글리콜릭 5-0 봉합사를 사용하여 절개한 근육을 봉합합니다. 별도로, 비 흡수성 폴리 프로필렌 6-0 봉합사를 사용하여 피부를 봉합하십시오.
11. 수술 및 마취 정지 시간을 기록합니다. 마우스를 새로운 깨끗한 케이지로 되돌리기 전에 회복 케이지에서 혼자 깨어나도록 합니다.
    참고: 수술 내내 동물의 발가락을 꼬집어 마취의 적절한 유지를 확인하고 호흡과 신체 관류(빨간색, 분홍색, 창백함)를 모니터링합니다. 호흡이 현저히 감소하거나 동물이 창백해 보이면 마취 흐름을 줄이거나 산소 흐름을 늘리는 것을 고려하고 식염수로 채워진 주사기를 피하 주사하여 동물을 재수화할 준비를 하십시오. 동물은 항상 몸의 따뜻함을 유지하기 위해 열원을 그 아래에 두어야합니다.

6. 대조 동물에 대한 가짜 수술 절차

1. 수술 절차의 5.1-5.11 단계를 따르십시오. 5.4-5.9단계를 제외합니다.

7. 수술 후 행동 검사

알림: 실험자가 모든 치료에 대해 눈이 멀었는지 확인하십시오. 만성 신경병성 통증은 수술 후 2주에 걸쳐 발생하며, 그 후 관심 화합물 투여 후 행동 검사를 수행할 수 있습니다.

1. von Frey, Hargreaves 또는 Hot plate 테스트를 사용하여 열적 및 기계적 과민성과 잠재적 반전을 평가합니다.
2. 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 설명한 종점 기준을 충족하는 경우 연구에서 동물을 제거합니다.
3. 행동 테스트가 끝날 때 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 설명한 절차에 따라 동물을 안락사시킵니다.

8. 데이터 분석

1. 폰 프레이:
   1. Chaplan과 동료²³에 의해 기술된 바와 같이, Dixon의 비모수적 방법을 사용하여 데이터를 분석하고, 데이터를 평균 인출 임계값으로 표현한다.
      1. 참조된 소프트웨어의 기본 페이지( 재료 표 참조)에서 스터디에 사용된 모든 필라멘트(2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 및 4.56)를 선택합니다. 그룹 패널에서 마지막 시뮬레이션에 해당하는 필라멘트를 선택합니다. 빈 상자에 긍정적(X ) 및 부정(o) 응답을 보고합니다. 관찰된 반응 패턴의 왼쪽에 있는 상자에 보고된 임계값을 기록합니다.
         참고: 패턴 및 정량화의 예는 보충 그림 S2에 나와 있습니다.
2. 하그리브스와 핫 플레이트 :
   1. 추가 통계 분석을 위해 스프레드시트에 대기 시간을 보고합니다.
   2. 결과를 민감도(임계값 또는 대기 시간)의 평균으로 시간 함수로 표시합니다.

9. 신경 유리 고리를 만드는 방법에 대한 지침

알림: 이 과정에서 화재 안전을 실천하십시오. 필요에 따라 내열 장갑이나 안경과 같은 적절한 보호 장치를 착용하십시오.

1. 분젠 버너를 켭니다.
2. 유리 막대(A)의 한쪽 끝을 한 손으로 불에 붙입니다. 이 유리 막대가 녹을 때 다른 손에 있는 다른 유리 막대(B)를 사용하여 막대 A의 녹는 유리를 안내하고 당깁니다. 유리 막대 A를 불에서 꺼내고 녹은 부분의 끝이 자연스럽게 안쪽으로 굴러 작은 공 모양을 형성하도록 합니다. 유리 막대 B를 사용하여 이 모양을 안내합니다.

만성 신경병성 통증은 C57Bl6/J 수컷 마우스의 좌골 신경의 부분 결찰을 통해 유도되었습니다(그림 1A). 기계적 감도는 폰 프레이 필라멘트와 "상하" 방법을 사용하여 평가되었습니다. 열에 대한 열 민감도는 Hargreaves 및 핫 플레이트 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 모든 데이터는 시간 경과에 따른 가짜 동물에 대한 pSNL 수술의 효과 또는 모르핀 및 이부프로펜의 다른 용량의 효과를 비교하기 위해 Geisser-Greenhouse 보정을 사용한 반복 측정 양방향 ANOVA로 분석되었습니다.

pSNL 수술을 받은 마우스는 28일 동안 가짜 동물에 비해 기계적 자극에 대한 역치가 더 낮은 것으로 나타났습니다(그림 1B). 열 과민성 평가에서도 유사한 결과가 얻어졌다. 복사열 자극에 노출된 후 발 금단 잠복기는 pSNL 동물에서 증가했으며(그림 1C), 동물을 52°C 플레이트에 놓았을 때 금단 잠복기가 증가했습니다(그림 1D).

만성 신경병성 통증이 확립된 후 수술 14일 후, 다양한 용량의 모르핀 또는 이부프로펜의 항통각 수용 효과를 평가했습니다. 마우스에 식염수 또는 두 가지 다른 용량의 모르핀(1 및 5mg/kg)을 복강 주사했습니다. 모르핀 주사 그룹 모두 pSNL 유발 과민증의 역전을 보였으며, 이는 1(1mg/kg)에서 2시간(5mg/kg)까지 지속되었습니다(그림 2A). 기계적 과민증은 모르핀 주사 후 4시간 후에 기준선으로 돌아왔습니다. 두 가지 다른 용량의 이부프로펜(10 및 30mg/kg)을 생쥐에 복강 내 투여했을 때 식염수 주사 생쥐에 비해 기계적 과민증이 감소한 것으로 나타났습니다(그림 2B). 이부프로펜의 항 통각 효과는 최대 2 시간 지속되었습니다. 전반적으로, 결과는 pSNL 수술이 오래 지속되는 만성 신경병성 통증을 유발한다는 것을 입증했습니다. 또한, 우리는 이 모델이 다양한 용량의 진통제에 민감하다는 것을 입증할 수 있었습니다.

그림 1: 좌골 신경의 부분 결찰로 인한 생쥐의 오래 지속되는 열 및 기계적 과민증. 만성 신경병성 통증(pSNL) 모델에서 과민증의 유도 및 지속성을 조사하기 위해 열에 대한 열 민감도(Hargreaves 및 열판 테스트) 및 von Frey 필라멘트에 대한 기계적 민감도를 평가했습니다. 좌골 신경을 결찰하기 전에 기준선 값을 측정하고 수술 후 28일 동안 과민도를 평가했습니다. (A) 그림은 좌골 신경의 부분 결찰을 나타냅니다. (B) 기계적 금단 역치는 각 시점에서 가짜 마우스와 pSNL 마우스 사이에서 비교되었습니다. Geisser-Greenhouse 보정을 사용한 반복 측정 양방향 ANOVA는 pSNL의 유의한 효과를 나타냈습니다(NS(1, 10) = 222.3, p < 0.0001, 조건당 n = 5-7). Sidak의 다중 비교 테스트는 1일에서 28일 사이에 과민증이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(p < 0.05). (C) Hargreaves 테스트로 측정한 열 인출 대기 시간을 가짜 마우스와 pSNL 마우스 간에 비교했습니다. Geisser-Greenhouse 보정을 사용한 양방향 ANOVA의 반복 측정은 pSNL의 유의한 효과를 나타냈습니다(NS(1, 8) = 113.8; p < 0.0001, n = 조건 당 4-6). Sidak의 다중 비교 테스트는 2일과 14일에 과민증이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(p < 0.05). (D) 열판 테스트에 의해 측정된 열 인출 대기 시간을 가짜 마우스와 pSNL 마우스 사이에서 비교했습니다. 일반적인 이원 ANOVA는 pSNL의 유의한 효과를 나타냈다(조건당 NS(1, 32) = 19.10, NS = 0.0001, n = 4-6). Sidak의 다중 비교 테스트는 pSNL 수술 후 4주에 열에 대한 민감도가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(p = 0.0026). 데이터는 평균 ± S.E.M. 약어로 표시됩니다: pSNL = 좌골 신경의 부분 결찰; BL = 기준선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 모르핀 또는 이부프로펜의 복강내 주사에 의한 pSNL 유발 기계적 과민증의 용량 의존적 역전. 기계적 과민증(폰 프레이 필라멘트 사용)을 평가하여 pSNL의 마우스 모델에서 모르핀 또는 이부프로펜의 잠재적인 항통각 수용 효과를 조사했습니다. 기준선 값(pre-pSNL)은 좌골 신경 결찰 전에 획득되었습니다. 만성 신경병증성 통증이 확립된 후, 14일째에 pSNL 유발 과민증(pSNL 후)을 보장하기 위해 동물을 두 번째로 기준선으로 설정했습니다. 그런 다음 모르핀(1/5mg/kg) 또는 이부프로펜(10/30mg/kg)을 2회 복강주사했다. 기계적 과민증의 잠재적 역전은 주사 후 4시간 동안 평가되었습니다. (A) 식염수 상태와 2회 용량의 모르핀 사이에서 기계적 금단 역치를 비교했습니다. Geisser-Greenhouse 보정을 사용한 반복 측정 양방향 ANOVA는 1mg/kg 모르핀의 유의미한 효과(NS(1, 11) = 11.16, NS = 0.0066, 조건당 n = 6-7)와 5 mg/kg 모르핀의 유의한 효과(NS(1, 10) = 21.78, NS = 0.0009, 조건당 n = 6). Sidak의 다중 비교 테스트는 두 용량 모두에 대해 주사 후 1시간 후에 기계적 과민증이 유의하게 감소한 것으로 나타났지만 2시간에서 5mg/kg 조건에서는 유의한 효과만 나타났습니다(*p < 0.05). (B) 식염수 상태와 이부프로펜의 2회 용량 사이에서 기계적 금단 역치를 비교했습니다. Geisser-Greenhouse 보정을 사용한 반복 측정 양방향 ANOVA는 10mg/kg 이부로펜의 유의미한 효과(NS(1, 11) = 7.788, NS = 0.0176, 조건당 n = 6-7)와 30mg/kg 이부프로펜의 유의한 효과를 나타냈습니다(NS(1, 10) = 18.79, NS = 0.0015, 조건당 n = 6). Sidak의 다중 비교 테스트는 두 용량 모두에 대해 주사 후 1시간 및 2시간에 기계적 과민증이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(*p < 0.05). 데이터는 평균 ± S.E.M. 약어로 표시됩니다: pSNL = 좌골 신경의 부분 결찰; IP = 복강 내. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 수술 도구. 두 사진은 수술에 사용되는 다양한 도구를 보여줍니다. (A) 미세 카스트로비에호 바늘 홀더; (B) 카스트로비에호 바늘 홀더; (C) 마이크로 애드슨 겸자; (D) 초미세 Graefe 집게; (e) 신경유리 후크; (F) 미세 가위(11.5cm); (g) 가는 가위(9cm); (h) 집게를 묶는 단계; (I) 홍채 겸자. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: von Frey 필라멘트 테스트로 측정한 발 금단 반응의 대표적인 패턴. 이 시험에서 마우스는 처음 세 번의 자극에 반응하지 않았지만 4.56 필라멘트로 네 번째 자극에서 발을 뺐습니다. 양성 반응(x)에 이어 더 얇은 필라멘트를 사용했고(4.31), 마우스가 다른 필라멘트에 반응하지 않을 때까지 더 작은 크기의 필라멘트(이 경우 4.08)를 사용했습니다. 실험자는 반응(o)이 없을 때까지 필라멘트의 크기를 하나씩 줄여야 합니다. 반응이 없는 후, 실험자는 긍정적인 반응을 얻을 때까지 더 두꺼운 필라멘트를 사용하고 긍정적인 반응(여기서는 4.31 필라멘트로 얻음)에 따라 크기를 줄였습니다. 첫 번째 긍정적 반응에 따라 4가지 자극이 수행되었습니다. 각 자극의 연대순 패턴은 패널 A에 빨간색 숫자로 주석이 달려 있습니다. 이 경우, 필라멘트 2.44 내지 3.22는 동물이 3.61 필라멘트에 대해 양성 반응을 나타내지 않았기 때문에 결코 사용되지 않았다. (B) 그런 다음 응답 패턴을 Allodynia 소프트웨어로 작성하고 필라멘트가 적용된 것과 동일한 순서(000xx0x0)로 흰색으로 강조 표시된 상자에 보고했습니다. 이어서, 결과 임계값을 소프트웨어에 의해 계산하였다(2.60839). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: von Frey 테스트를 위한 데이터 수집 시트. 이 표를 통해 실험자는 von Frey 필라멘트를 사용할 때 응답 패턴을 채울 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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