이 프로토콜은 마우스의 개별 골격근에서 근육 줄기 세포와 섬유 지방 생성 전구체의 분리를 설명합니다. 이 프로토콜에는 단일 근육 해부, 형광 활성화 세포 분류에 의한 줄기 세포 분리, 면역형광 염색에 의한 순도 평가, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine 혼입 분석에 의한 S상 진입의 정량적 측정이 포함됩니다.
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방법 논문
개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
골격근은 조직의 항상성과 복구에 기여하는 뚜렷한 성체 줄기 세포 집단을 가지고 있습니다. 골격근 줄기 세포(MuSC)는 새로운 근육을 만드는 능력이 있는 반면, 섬유 지방 생성 전구세포(FAP)는 기질 지지 조직에 기여하고 섬유아세포와 지방 세포를 만드는 능력이 있습니다. MuSC와 FAP는 모두 정지라고 하는 장기간의 가역적 세포 주기 종료 상태에 있습니다. 정지 상태는 기능의 핵심입니다. 정지 줄기 세포는 일반적으로 단일 샘플에 함께 모인 여러 근육 조직에서 정제됩니다. 그러나 최근 연구에서는 다른 근육에서 분리된 MuSC의 분자 프로파일과 정지 깊이에서 뚜렷한 차이가 있음이 밝혀졌습니다. 현재 프로토콜은 개별 골격근에서 MuSC 및 FAP의 분리 및 연구를 설명하고 줄기 세포 활성화의 분자 분석을 수행하기 위한 전략을 제시합니다. 횡격막, 삼두근, 그라실리스, 전경골근(TA), 비복근(GA), 가자미근, 장신근(EDL) 및 교근과 같은 다양한 발달 기원, 두께 및 기능의 근육을 분리하고 소화하는 방법을 자세히 설명합니다. MuSC 및 FAP는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 정제되고, 면역형광 염색 및 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU) 혼입 분석에 의해 분석된다.
서론
골격근은 근육 줄기 세포(MuSC)의 존재로 인해 재생 능력이 높습니다. MuSC는 기저층 아래의 근섬유에 위치하며 1,2,3,4번 출구로 나오는 장기간의 가역적 세포 주기의 정지 상태에 있습니다. 손상 시 MuSC는 활성화되고 세포 주기에 들어가 분화 및 융합하여 새로운 근섬유를 형성할 수 있는 증폭 전구체를 생성합니다 2,5. 이전 연구에서는 MuSC가 근육 재생에 절대적으로 필수적이라는 것을 보여주었습니다 6,7,8. 또한, 단일 MuSC는 새로운 줄기세포와 새로운 근섬유를 생착시켜 생성할 수 있다9. 골격근은 또한 섬유 지방 생성 전구 세포 (FAPs)라고 불리는 중간 엽 기질 세포 집단을 보유하고 있으며, 이는 근육 재생
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프로토콜
본 프로토콜은 오르후스 대학교의 동물 관리 지침 및 지역 윤리 규정에 따라 수행되었습니다.
알림: 동물 실험 및 사후 설치류 샘플 취급에 대한 지역 윤리 위원회의 규정을 준수해야 합니다. 마우스는 알레르겐의 잠재적 공급원입니다. 가능한 경우 배기 환기를 켜고 알레르겐에 과도하게 노출되지 않도록 작업 공간 위에 놓으십시오. 또는 실험이 정기적으로 수행되는 경우 안면 마스크를 착용하십시오. 이 프로토콜에는 날카로운 물건 작업이 포함되며 연구원은 절단 시 응급 처치를 적용하기 위한 절차와 물류를 숙지하는 것이 좋습니다.
1. 준비 (1-2 시간, 해부 전날)
알림: 용액, 플레이트 및 배지는 달리 명시되지 않는 한 사용 전에 멸균 조건에서 준비되고 여과(0.45μm)됩니다. dispaase(PBS에서 11U/mL) 및 collagenase II(PBS에서 1.000U/mL)의 저장 용액을 준비하고 -20°C에서 보관합니다(표 1). 스톡은 해동되어 4.2.6 단계에서 2 차 소화에 사용됩니다.
- 96웰 반면적 플레이트의 콜라겐 코팅
- 산성 물을 준비하십시오. 5.....
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결과
개별 골격근 분리를 위한 프로토콜(그림 2)에 따라 그라실리스, TA, EDL, GA, 가자미근, 삼두근, 교근 및 횡격막 근육을 지역 육종 프로그램에서 중단된 3마리의 스위스 수컷 이종 교배 마우스에서 분리했습니다(그림 2). 조직 해리 및 항체 염색에 이어 개별 근육의 MuSC 및 FAP를 FACS로 정제했습니다(그림 3). 염색되지 않은 샘플로 초기 게이팅을 얻어 세포를 식별하고 이중선에서 싱글렛을 분리했습니다(그림 3A). 염색 역치를 식별하기 위해 FMO 대조군을 사용하여 후속 게이트를 설정했습니다(그림 3B). 그런 다음 염색된 샘플을 CD31/CD45-FITC 및 Sca1-PacBlue에 대해 게이팅했습니다. SCA1+/CD31
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토론
좋은 수율을 달성하기 위해 이 프로토콜을 실행하는 데 몇 가지 단계가 중요합니다. 개별 근육은 대량 격리 프로토콜에 사용되는 근육의 양에 비해 부피가 작습니다. 이로 인해 해부 중에 근육이 건조되어 수율이 감소할 위험이 있습니다. 이를 방지하려면 해부 직후 근육에 배지를 추가하는 것이 중요합니다. 또한 해부가 더 오래 걸리면 한 번에 한쪽 팔다리에서 피부를 제거하여 근육이 공기에 노출되는 시간을 줄일 수 있습니다. 부피가 작을수록 과소화 위험이 증가합니다. 이에 대응하기 위해, 본 방법은 벌크 근육 프로토콜에 비해 더 적은 양의 콜라게나제 II 효소와 감소된 소화 시간을 필요로 한다 9,16. 효소 분해는 또한 효소의 순도에 따라 달라지며 순도가 낮으면 수율에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 기계적 소화가 중요합니다. 절단이 불충분 한 경우, 감소 된 표면적은 효소 소화를 방해하고 줄기 세포 수율을 낮 춥니 다. 너.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계와 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
세포 분류는 덴마크 오르후스 대학교의 FACS Core Facility에서 수행되었습니다. 그림은 Biorender.com 사용하여 만들어졌습니다. 토끼 항-PDGFRa 항체를 공유해 주신 J. Farup 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 E.P.에 대한 AUFF 시작 보조금 및 NovoNordiskFonden에서 E.P. (0071113) 및 A.D.M. (0071116)에 대한 시작 패키지 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 튜브(PCR 성능 테스트 완료, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL |
| tube 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브 | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS 튜브 스트레이너 캡 |
| 없음 5 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 셀 스트레이너 캡 | Falcon, Fisher Scientific | 스 | 트레이너 캡이 있는 352235 FACS 튜브 |
| 5 mL 튜브(PP, 비멸균 오토클레이브 가능) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL 튜브 |
| 50 mL 튜브( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
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| Alexa Fluor 647 당나귀-안티 마우스 IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
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| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | 세포 증식 키트 |
| 콜라겐 송아지 피부 | 생물 시약, Sigma Aldrich | 출처: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| 콜라겐 분해 효소 유형 II | Worthington, Fisher Scientific | 로트: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
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| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight junps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | 곡선 집게 |
| F-10 영양소 혼합물 (햄) (1x), +L-글루타민 | Gibco, Fisher Scientific | 2453614 (cat# 31550-023) | |
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| 빙산 (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| 헤드 오버 헤드 미니 튜브 로테이터 | 피셔 사이언티픽 | 15534080 (모델 번호 88861052) | 헤드 오버 헤드 미니 튜브 로테이터 |
| 호스 세럼 | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | 쉐이킹 워터 배스 |
| MS2 미니 쉐이커 | 이카 | 소용돌이 단위 | |
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| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | 163589 (cat# 11548876 ) | |
| 피펫 팁 p10 | Art tips, 자가 밀봉 장벽, Thermo Scientific | 2140-05 | Low Retention, pre-sterilized, 필터 팁 |
| 피펫 팁 p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | 저보유, 사전 멸균, 필터 팁 |
| 피펫 팁 p200 | 아트 팁, 자체 밀봉 장벽, Thermo Scientific | 2069-05 | 저보유, 사전 멸균, 필터 팁 |
| 보호용 언더패드 | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 레이어 |
| Rainin, 피펫 라이트 XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | 피펫 (P10, P20, P200, P1000) |
| 재조합 anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| 메스(샤프트 번호 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | 메스 |
| 메스 블레이드 번호 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | 메스 |
| Scanlaf 화성 | Labogene | 클래스 2 캐비닛: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | 현미경, 핵심 시설 Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | 인큐베이터 |
| 혈청학 피펫 10 mL | VWR | 612-3700 | 멸균, 비발열성 |
| 혈청학 피펫 5 mL | VWR, Avantor VWR | 612-3702 | 멸균, 비발열성 |
| 주사기 5 mL, 루어 팁 (6%), 멸균; | BD 에메랄드, 피셔 사이언티픽 | 307731 | 시린지 |
| TC 디쉬 100, 표준 | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | 페트리 디쉬 |
| 조직 배양(TC) 처리 표면, 검은색 폴리스티렌, 평평한 바닥, 멸균, 뚜껑, 20개 팩 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96웰 절반 바닥 플레이트 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | 출처: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
참고문헌
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Cheung....
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