면역조직화학에 의한 비정상적인 프리온 단백질 검출

요약

면역조직화학 프로토콜을 사용하여 비정상 프리온 단백질을 면역표지하려면 특정 샘플 및 항-PrP 항체 준비 방법론이 필요합니다. 본 프로토콜은 적절한 PrP 면역표지를 보장하고 비특이적 배경 염색을 최소화하기 위한 에피토프 마스킹의 주요 단계를 설명합니다. 또한, 이 접근법은 프리온 감염 조직으로 면역조직화학 연구를 수행할 때 생물학적 안전성 조치를 고려합니다.

초록

비정상 프리온 단백질(PrP,^Sc)은 세포 프리온 단백질의 질병 관련 동형이며 전염성 해면상 뇌병증(TSE)의 진단 마커입니다. 이러한 신경퇴행성 질환은 인간과 여러 동물 종에 영향을 미치며 스크래피, 인수공통전염병(BSE), 만성 자궁경부 소모성 질환(CWD) 및 새로 확인된 낙타 프리온 질병(CPD)을 포함합니다. TSE의 진단은 뇌 조직, 즉 뇌간(obex 수준)에 면역조직화학(IHC)과 웨스턴 면역블롯 방법(WB)을 모두 적용하여 PrP^Sc의 면역검출에 의존합니다. IHC는 조직 절편의 세포에서 관심있는 항원에 대해 1 차 항체 (단일 클론 또는 폴리 클로날)를 사용하는 널리 사용되는 방법입니다. 항체-항원 결합은 항체가 표적이 된 조직 또는 세포 영역에 국한된 채로 남아 있는 색 반응에 의해 시각화될 수 있습니다. 따라서 프리온 질병에서 다른 연구 분야와 마찬가지로 면역 조직 화학 기술은 진단 목적뿐만 아니라 병인 연구에도 사용됩니다. 이러한 연구는 새로운 프리온 균주를 식별하기 위해 이전에 설명한 것에서 PrP^Sc 패턴 및 유형을 검출하는 것을 포함합니다. BSE는 인간을 감염시킬 수 있으므로 TSE 감시에 포함된 소, 작은 반추 동물 및 자궁경부 샘플을 처리하기 위해 생물안전 실험실 레벨 3(BSL-3) 시설 및/또는 관행을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 오염을 제한하기 위해 가능하면 봉쇄 및 프리온 전용 장비를 권장합니다. ^PrPSc IHC 절차는 이 기술에 사용된 포르말린 고정 및 파라핀 포매 조직이 감염성을 유지하기 때문에 프리온 불활성화 측정으로도 작용하는 포름산 에피토프 데마스킹 단계로 구성됩니다. 결과를 해석할 때 비특이적 면역 표지와 표적 표지를 구별하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 이러한 목적을 위해, 본원에 추가로 기술된 TSE 균주, 숙주 종 및 prnp 유전자형 간에 변할 수 있는 특정 PrPS^Sc 면역표지 유형으로부터 이들을 구별하기 위해 공지된 TSE-음성 대조군 동물에서 얻어진 면역표지의 인공물을 인식하는 것이 중요하다.

서론

프리온 가설에 따르면, 비정상적인 동형(^PrPSc)은 전염성 해면상 뇌병증(TSE)에서 감염원의 주요 또는 유일한 구성 요소입니다. TSE 진단을 위한 확인은 면역조직화학(IHC) 프로토콜 및/또는 뇌 조직의 웨스턴 면역블롯 방법(WB)을 적용하여 PrP^Sc 의 면역검출에 의존합니다¹.

IHC는 조직 절편의 세포에 위치하는 특이적 표적화된 관심 항원의 면역염색의 첫 번째 단계로서 단일클론 항체 또는 일부 경우에 다클론 항체(1차 항체)를 사용하는 방법입니다. 임의의 효과적인 1차 항체-항원 결합은 1차 항체에 특이적인 2차 항체를 사용하여 시각화된다. 이러한 2차 항체는 양 고추 냉이 과산화 효소 (HRP) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP)와 같은 효소에 접합됩니다. 그런 다음 이러한 효소에 기질을 추가하여 1차 항체가 표적 항원에 결합하는 영역에 국한된 불용성 색상 제품을 생성함으로써 시각화를 달성합니다. 개선된 시각화는 대조염색에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 염료는 면역표지된 조직과 면역표지되지 않은 조직 사이의 대조를 생성하기 위해 사용된다².

포르말린 고정 파....

프로토콜

여기에 설명 된 IHC 절차는 연구 프로젝트 FAIRJ-CT98-7021, "반추 동물 TSE의 감시를위한 유럽 네트워크 구축 및 의심 사례 식별을위한 프로세스 및 기준의 표준화 및 조화"의 구성 요소입니다. 이는 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health), WOAH(이전에는 Office International des Épizooties, OIE)¹ 및 동물 TSE에 대한 유럽 참조 실험실(European Reference Laboratory for animal TSEs ^8,11)에서 정의한 진단 기준을 따릅니다. 설명된 IHC 절차는 2008년부터 NPISOIEC17025(테스트 및 교정 실험실의 역량에 대한 일반 요구 사항)에 따라 인증되었습니다. 이러한 인증은 표준 운영 절차, 자격을 갖춘 인력, 정확하게 보정된 장비, 데이터 및 시약의 엄격한 제어, 실험실 간 숙련도 분석 참여, 부적합 작업 및 위험 평가를 통합하여 관리 시스템의 효율성을 높이고 결과를 개선하며 실험실 위험을 방지하는 고품질 관리 시스템을 의미합니다. BSE, 고전적 스크래피, 비정형 스크래피 및 CWD를 사용한 프리온 감염 조직....

결과

비특이적 표적 면역 표지가 가능하다는 점을 감안할 때, 알려진 TSE 음성 대조군 동물에서 비특이적 면역 표지의 수준을 확인하는 것이 중요합니다. 이는 특정^PrPSc 면역표지를 적절하게 해석하기 위한 중요한 단계이다⁷(그림 2). 항-PrP 항체에 의한 비표적 표지는 별개의 신경내 미세 미립자 염색(설하 핵 및 부속 교미 핵에서 더 분명함), 신경필 내 얼룩의 불규칙한 미세 선형 실(STN, V, 올리브 핵, 부속 교미 핵, 측면 다발 핵, 올리브 핵에 대한 망상 형성 등쪽 및 후방 영역)으로 발생하는 것으로 나타났습니다^.12 , 일부 회백질 및 백질 영역에서의 확산 비미립자 표지, 뉴런¹³의 확산 세포질 표지(그림 3).

토론

TSE는 잠재적인 인수공통전염병입니다. 영국에서 1986에서 BSE가 출현 한 후, 포르투갈은이 질병의 발병률이 높은 유럽 연합 회원국 중 하나가되었습니다^14,15. 이 질병을 통제하기 위해 등장한 다른 TSE (고전적 및 비정형 스크래피, BSE 변종 및 현재 자궁 경부에서 만성 소모성 질환의 감시), 감시 메커니즘은 식품 수의학 총국 (DGAV)과 국립 농업 및 수의학 연구소, TSE 국립 수의학 연구소로 TSE 진단을 수행하는 IP (INIAV). 이 실험실은 권장되는 생물 안전 BSL-3 시설을 따르고 TSE 감시와 관련된 소, 작은 반추 동물 및 자궁 경부의 잠재적인 프리온 감염 조직 샘플을^{관리하는 데 6}을 수행합니다. 뇌 및 림프 조직의 면역조직화학(IHC) 및/또는 웨스턴 면역블롯 방법(WB)에 의한^PrPSc의 면역검출은 TSE

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
절대 에탄올	Labchem	LB0507-9010	미정&
nbsp;			증류수에 90%, 70%, 50%를 희석했습니다.
Avidin-biotin complex 및 peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	키트 지침에 따라 사용하기 30분 전에 준비하고 부드럽게 혼합하십시오. 서 있는 후에는 섞지 마십시오.
비오틴화된 2차 항체 (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	10% 말 일반 혈청으로 TBS에서 1/200으로 희석합니다. 섹션 수에 따라 필요한 볼륨을 준비합니다.
크로모겐 디아미노벤지딘- DAB, 기판 키트, 과산화효소	Vector Laboratories	SK-4100	키트 지침에 따라 사용하기 전에 준비하십시오. 400 µ를 사용하십시오. 섹션당 솔루션의 L.
DakoCytomation 파스칼 압력 챔버	DAKO	S2800
Ehrlich' s 헤마톡실린:
헤마톡실린	머크	115938	2g의 헤마톡실린을 100mL의 앱솔루트 에탄올에 용해시킵니다. 증류수 100mL, 빙초산 10mL, 명반 칼륨 15g을 넣고 계속 저어주면서 넣는다. 글리세린 100mL를 추가합니다. 자연 산화 과정은 사용하기 전에 2개월이 걸립니다.
절대 에탄올	Labchem	LB0507-9010
빙하 아세트산	Merck	101830
칼륨 명반	Merck	1.01047.1000
글리세린	Merck	1.04091.1000
내인성 과산화효소 차단 용액 (3 % 농도 H2< / sub>O2< / sub>) :			360mL 메탄올 중 40mL 과산화수소 (30 % w / w). 사용 전 준비
과산화수소 (30 % w / w)	Scharlau	HI0136
메탄올	Sigma Aldrich	322415-2L
포름산 98%	Merck	1.00264.1000	미희석
마이크로톰	Shandon-AS325	마이크로톰	샨돈-AS325
장착 매체 Entellan	Merck	107960	즉시 사용 가능.
TBS의 일반 세럼 (20%) 블록 솔루션: Horse 일반 세럼	Gibco	16050-122	분석의 절편 수에 따라 최종 부피를 준비합니다 (200 µ L의 단면당 용액).
1차 항체 항-PrP 마우스 MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 비정형 스크래피, 자궁경부, 고양이를 포함한 양. bovine. 분석의 절편 수에 따라 적합하지 않습니다(200 &마이크로; L of solution per section) 및 항체 희석, 2차 항체가 상승한 종의 정상 혈청 10%가 보충된 TBS에서 최종 부피를 준비합니다(말 정상 혈청) 일반 항체 희석: MAb 2G11 1/100 그러나 가장 낮은 배경에서 가장 강력한 라벨링을 제공하기 위해 농도를 얻기 위해 모든 새로운 배치에서 작업 희석을 설정해야 합니다. 저장을 위해 최소 10 &mu의 부분 표본 부피를 동결하십시오. L을 멸균 마이크로튜브에 넣습니다. 해동하고 한 번에 하나의 부분 표본을 사용하십시오.
1차 항체 항-PrP 마우스 MAb 12F10	케이맨  화학 회사	189710	PrP142-160 소, 양에 적합하지 않음 일반적인 항체 희석: 1/200이지만 작동 희석도 확립되어야 합니다. MAb 2G11
Shandon CoverplateTM 챔버	Thermo Scientific
Shandon Sequenza® 면역 염색 센터	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® 면역 슬라이드 랙	Thermo Scientific	73310017
용액 구연산염 완충액 (10 mM pH 6.1):			2.55 g 구연산 삼나트륨 이수화물  및 0.255 g 구연산을 1리터 정제수에 담았습니다. 10 mM 구연산 용액 (500 mL 정제수 중 1.05 g 구연산)을 사용하여 작업 용액의 pH를 6.1로 조정합니다 분석 당일에 준비합니다.
Tri-sodium citrate dihydrate	시그마-알드리치	S4641-500G
시트르산	Sigma Aldrich	C0759
염색 항아리와 바구니	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus 현미경 슬라이드	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA base; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (원액 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): 800 mL 정제수 중 TRIZMA 염기 60,57 g 및 NaCl 80 g. 염산 37%를 사용하여 원액의 pH를 조정하고 정제수로 최종 부피를 1리터로 조정합니다(5± 3° C 2개월까지) 분석 당일에 TBS 원액 1/10을 희석합니다.
TRIZMA BASE	시그마 Aldrich	T6066-1KG
염화나트륨 (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW 시약	251769	희석되지 않음

는 로 준비 72110017