Rickettsia spp.를 Tick 세포주에서 형광 단백질 발현 셔틀 벡터로 형질전환하기 위한 전기천공 방법

요약

전기 천공은 Rickettsia 속에 외인성 DNA를 도입하기 위해 빠르고 광범위하게 채택 된 방법입니다. 이 프로토콜은 Rickettsia 속의 절대 세포 내 박테리아의 형질 전환에 유용한 전기 천공 방법을 제공합니다.

초록

리케차증은 감염된 절지 동물 벡터의 물기를 통해 척추 동물 숙주로 전염 될 수있는 Rickettsia 속에 속하는 광범위한 절대 세포 내 박테리아에 의해 발생합니다. 현재까지 신흥 또는 재출현 유행성 리케차증은 진단 방법이 제한적이고 표준화되거나 보편적으로 접근 할 수 없기 때문에 진단의 어려움으로 인해 공중 보건 위험으로 남아 있습니다. 징후와 증상에 대한 인식 부족으로 인한 오진은 항생제 치료가 지연되고 건강 결과가 좋지 않을 수 있습니다. 리케차 특성에 대한 포괄적 인 이해는 궁극적으로 질병의 통제 및 예방을 개선하여 임상 진단, 평가 및 치료를 향상시킬 것입니다.

리케차 유전자의 기능 연구는 병인에서의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 이 논문은 셔틀 벡터 pRAM18dSFA를 사용하여 리케차 파케리 균주 테이트 헬의 전기천공법과 항생제(스펙티노마이신 및 스트렙토마이신)를 사용한 진드기 세포 배양에서 형질전환된 R. 파케리 의 선택을 위한 절차를 설명합니다 . 벡터 세포주에서 형질전환을 확인하는 데 유용한 기술인 공초점 면역형광 현미경을 사용하여 진드기 세포에서 형질전환된 R. parkeri 의 국소화에 대한 방법도 설명합니다. 유사한 접근법이 다른 리케차의 변형에도 적합합니다.

서론

리케차증은 리케차 (Rickettsiaceae 가족, 리케차 시알 레스 주문)에 속하는 광범위한 절대 세포 내 박테리아에 의해 발생합니다. Rickettsia 속은 계통 발생 특성^1,2에 따라 4 개의 주요 그룹으로 분류됩니다 : 가장 심각하고 치명적인 진드기 매개 리케차증을 유발하는 리케차(예: Rickettsia rickettsii, 로키 산 홍반열의 원인균), 발진티푸스 그룹(TG^, 예: Rickettsia prowazekii, 유행성 발진티푸스의 대리인), 과도기 그룹 (TRG, 예 : 리케차 펠리스, 벼룩 매개 홍 반열의 원인균) 및 조상 그룹 (AG, 예 : 리케차 벨리).

가장 오래된 알려진 벡터 매개 질병 중 리케차증은 주로 진드기, 벼룩, 이 및 진드기를 포함한 감염된 절지동물 벡터의 물기를 통해 병원체가 전염된 후 획득됩니다^3,4. 효과적인 항생제의 발견으로 치료 결과가 개선되었지만 새롭게 등장하고 다시 등장하는 전염....

프로토콜

1. 진드기 세포 배양에서 R. parkeri 의 번식 및 정제

참고: 모든 세포 배양 절차는 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 준비 R. parkeri-감염된 진드기 세포
   1. 5% 소 태아 혈청(FBS), 5% 트립토스 인산염 액체(TPB) 및 0.1% 지단백질 농축액(LPC)이 보충된 L15C300 배지¹⁷ 5mL에서 34°C의^25cm2 세포 배양 플라스크에서 ISE6 세포를 성장시킵니다.
      참고: ISE6(Ixodes scapularis 배아 유래 세포주)는 많은 실험실에서 광범위하게 사용되는 진드기 세포주이므로 진드기-병원체 상호 작용을 연구하는 데 필수적인 모델입니다^17,18,19. ISE6 세포의 성장 속도는 포유류 세포보다 느리며 개체군 배가 시간은 ≥72 시간입니다. 예를 들어, 100% 컨플루언트 배양에서 1:5의 비율로 재배양된 ISE6 세포는 100% 컨플루언스를 회복하는 ....

결과

Giemsa 염색 후 광학 현미경으로 ISE6 세포에서 R. parkeri의 형태를 도 1에 나타내었다. 도 2에서, ISE6 세포에서 적색 형광 단백질을 발현하는 형질전환된 R. parkeri를 공초점 현미경을 사용하여 나타내었다. (A) 배양 7일째부터 (B) 10일째까지 ISE6 세포(청색, 핵에 해당)에서 형질전환된 R. 파케리(적색)의 감염률이 실질적으로 증가한다.

토론

여기에서는 전기 천공을 사용하여 셔틀 플라스미드 pRAM18dSFA에 암호화된 외인성 DNA를 리케차에 도입하는 방법을 시연합니다. 이 절차에서, 무세포 리케차는 숙주 세포로부터 정제되고, 리케차 셔틀 벡터로 형질전환되고, 감염을 위해 진드기 세포 상으로 방출되었다. 또한 진드기 세포에서 적색 형광 단백질 발현 R. parkeri 를 검출하기 위한 공초점 면역형광 절차가 설명되어 있습니다. 유사한 방법이 다른 리케차 종에도 적용 가능하며 추가 수정을 통해 플라스미드를 유지할 수있는 다른 절대 세포 내 박테리아에 적용 할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 성공적인 형질전환은 세 가지 성분을 필요로 한다: 외인성 DNA, 리케차 종 박테리아, 및 적합한 유형의 숙주 세포(²²). 특정 연구 목표에 따라 이러한 구성 요소를 변경할 수 있습니다. 먼저, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.1cm 갭 유전자 펄서 electroporation 큐벳	Bio-Rad	1652083
2 μ M 기공 크기 필터	GE 헬스케어 생명과학 Whatman	6783-2520
5 mL 루어-락 주사기	BD	309646
60-90 실리콘 카바이드 그릿	LORTONE, inc	591-056
앱솔루트 메탄올	Fisher Scientific	A457-4
Bacto 트립토스 인산염 육수	BD	260300
Cytospin 원심분리기 Cytospin4	Thermo Fisher Scientific	A78300003	로터는 분리 가능하여 전체 로터를 후드에 넣어 감염성 샘플을 로드할 수 있습니다
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	QIAGEN	12362	엔도톡신이 없는 pRAM18dSFA 플라스미드
확장 미세 팁 전송 피펫	Perfector Scientific	TP03-5301
태아 소 세럼	Gemini Bio	900-108	FBS 배치는 ISE6 세포가 잘 자랄 수 있는지 확인하기 위해 테스트해야 합니다.
Bio-Rad	165-2105 & 165-2110		가 있는 Gene Pulser II electroporator
	Thermo Fisher Scientific	267110
HEPES	Millipore-Sigma	H4034
ImageJ Fiji	National Institute of Health		원시 이미지 편집
KaryoMAX Giemsa stain	기코	2021-10-30
Leibovitz의 L-15 미디엄	Gibco	41300039
지단백질 농축물	MP Biomedicals	191476
Nikon Diaphot	Nikon		epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes 시약	Thermo Fisher Scientific	R37605
Olympus 디스크 스캐닝 유닛 (DSU) 컨포칼 현미경	Olympus
Petroff-Hausser 카운팅 챔버	Hausser Scientific	챔버 3900
중탄산나트륨	Millipore-Sigma	S5761
와류	피셔 소용돌이 지니 2	12-812

. 는 을 획득하는 데 사용됩니다.Pulse Controller PLUS 혈구계