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방법 논문

배양, 냉동, 처리 및 전체 오가노이드 및 스페로이드의 이미징 상태를 하이드로겔에 있는 동안

7.6K 조회수

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DOI:

10.3791/64563

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2022년 12월 23일

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1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

이 논문에서

요약

본 연구는 다양한 현미경으로 전체 스페로이드 및 오가노이드를 배양, 냉동, 해동, 가공, 염색, 라벨링 및 검사하는 방법론을 설명하지만 다목적 장치 내의 하이드로겔에 그대로 유지됩니다.

초록

세포 배양 실험실에서 3차원 성장 구조인 오가노이드와 스페로이드는 인체를 더 잘 모방하고 동물 연구에 비해 이점이 있기 때문에 2차원 배양 모델에 비해 우수한 모델로 점점 더 인식되고 있습니다. 그러나 이러한 연구는 일반적으로 재현성 및 일관성 문제에 직면합니다. 서로 다른 세포 배양 용기 간의 오가노이드 및 스페로이드 이동, 피펫팅 및 원심분리와 같은 긴 실험 과정에서 이러한 취약하고 깨지기 쉬운 3D 성장 구조는 종종 손상되거나 손실됩니다. 궁극적으로 3D 구조는 동일한 특성과 품질을 유지할 수 없기 때문에 결과에 큰 영향을 미칩니다. 여기에 설명된 방법은 이러한 스트레스가 많은 단계를 최소화하고 오가노이드 및 스페로이드가 다목적 장치의 하이드로겔에 있는 동안 처리 시퀀스 전반에 걸쳐 안전하고 일관된 환경을 보장합니다. 연구원들은 단일 다목적 장치를 사용하여 컨포칼에서 전자 현미경에 이르기까지 다양한 첨단 장비에서 오가노이드 또는 스페로이드의 구조를 성장, 냉동, 해동, 가공, 염색, 라벨링 및 검사할 수 있습니다. 이 기술은 연구의 재현성, 신뢰성 및 타당성을 개선하는 동시에 처리 중 3D 성장 구조에 대한 안정적이고 보호적인 환경을 유지합니다. 또한 스트레스가 많은 단계를 제거하면 취급 오류를 최소화하고 소요 시간을 줄이며 오염 위험을 줄일 수 있습니다.

서론

세포 연구 및 치료의 미래는 3D 세포 배양 1,2,3에 있습니다. 오가노이드 및 스페로이드 모델은 인체 발달, 생리학 및 질병 4,5,6,7,8,9 를 모방하는 더 나은 모델을 만들어 시험관 내 실험과 동물 모델 간의 격차를 좁힙니다. 그러나 이러한 모델의 재현성과 반복성은 여전히 어렵습니다. 또한 현재 기술로 이러한 구조를 취급, 수확, 이송 및 원심분리하면 많은 조건에서 오가노이드 및 스페로이드가 손실되거나 손상되어 결과에 큰 영향을 미칩니다.

조직학적 염색, 면역조직화학 염색, 면역형광 표지 및 동결보존을 위한 많은 프로토콜에도 불구하고 실험 조건을 표준화하고 이러한 섬세한 구조를 손실하거나 손상시키지 않고 취급 및 처리하는 것과 관련된 보편적인 접근 방식은 없습니다. 현재 프로토콜은 며칠에서 몇 주까지 번갈아 가며 엄청나게 길며 다양한 시약10,11,12,13,14를 사용한 복잡한 절차를 포함합니다. 또한 세포 배양 용기와 냉동 비알 간의 3D 성장 구조를 수확, 피펫팅, 원심분리 및 이송하면 구조의 위치와 기계적 힘이 변경되고 궁극적으로 오가노이드 및 스페로이드의 분화 및 성숙에 영향을 미칩니다. 조직 토폴로지, 세포의 위치 및 기계적 힘이 세포 분화 및 성숙에 상당한 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다 6,15,16,17.

따라서, 현재의 종래식 기술을 개선하여 안정적인 품질의 오가노이드 및 스페로이드를 생성하는 것이 바람직하다. 위에서 설명한 원심분리 및 기타 단계를 건너뛰고 여러 공정의 시작부터 끝까지 단일 안전한 환경에서 재료를 제공하는 방법/장치는 가장 일관되고 신뢰할 수 있는 데이터에 도달하는 데 도움이 될 것입니다. 또한 시간, 노동 및 비용 제약을 줄일 수 있습니다.

여기에 설명된 다목적 장치(MD)는 오가노이드 및 스페로이드의 여러 공정을 위한 단일 안전 환경을 제공합니다(보충 그림 1). 이 장치와 보완 프로토콜은 수확, 피펫팅, 이송 및 원심분리 단계를 제거합니다. 오가노이드와 스페로이드는 순차적 과정 동안 시험관 내 환경에 남아 있습니다. 이 환경은 주로 상업적으로 이용 가능한 하이드로 겔과 같은 천연 또는 합성 세포 외 기질 성분으로 구성됩니다. 즉, 여기에 설명된 방법을 사용하면 오가노이드/스페로이드의 전체 장착 샘플을 하이드로겔 방울에 있는 동안 처리, 검사 및 냉동할 수 있습니다.

생체 적합성 장치는 60 ° C에서 -160 ° C 사이의 온도에 견딜 수 있으므로 -160 ° C의 액체 질소 탱크에서 유기체 / 스테로이드를 복원하거나 60 ° C에서 전자 현미경 용 수지 블록을 준비 할 수 있습니다. 이 장치의 틈새는 3D 성장 구조를 위한 제한된 공간을 정의하고 이전 연구 18,19,20,21,22,23을 기반으로 스페로이드 또는 오가노이드의 형성을 자극하도록 설계되었습니다. 장치의 해당 부분은 투명하며 높은 광학 품질을 제공하는 특정 플라스틱을 포함합니다(굴절률: 1.43, abbe 값: 58, 두께: 7.8mil[0.0078in 또는 198μm]). 틈새와 주변의 '측면'부분 모두자가 형광을 유발합니다. 중앙의 투명한 틈새는 80mm 2 면적이고 측면 부분은 600mm2입니다. 용기의 깊이는 15mm이고 두께는 1.5mm입니다. 이러한 기능은 장치의 크기와 디자인 외에도 다양한 유형의 첨단 현미경에서 관찰하고 전자 현미경 검사를 위해 샘플을 준비 할 수있게합니다 (그림 2). 장치의 폐쇄 시스템은 냉동실에 밀봉 된 위치와 인큐베이터에서 가스 흐름을 허용하는 두 가지 위치를 제공합니다. CCK8 증식 및 세포 독성 분석은 전통적인 세포 배양 접시와 비교하여 세포에 대한 유사한 효과를 보여줍니다 (보충 그림 2). 트리판 블루 배제 테스트는 MD에서 세포 배양 중 높은 세포 생존율(94%)을 보여줍니다(그림 3).

단일 장치에서 하나의 샘플에 대해 수행할 수 있는 공정은 (1) 배양, (2) 조직학적 염색, (3) 면역조직화학 및 면역형광 표지를 포함한 면역염색, (4) 동결, (5) 해동, (6) 명시야, 암시야, 형광, 공초점 및 초고해상도 현미경과 같은 광학 현미경으로 검사, (7) 주사 전자 현미경으로 직접 코팅 및 검사, 또는 (8) 투과 전자 현미경 준비( 그림 2).

조직학적 염색, 면역조직화학적 표지 또는 형광 표지 오가노이드 및 스페로이드 10,11,12,13,14,24,25에 대한 다양한 방법론이 존재합니다. 하이드로겔에서 이를 수확하는 것은 현재 기술의 첫 번째이자 주요 단계입니다. 이 단계 후에 일부 방법은 전체 마운트 면역 표지를 허용합니다. 수확된 오가노이드는 파라핀에 포매되고, 절편화되고, 다른 오가노이드의 염색 및 면역염색을 위해 표지됩니다. 그러나 섹션은 전체 샘플을 제공하지 않을 수 있으며 구조의 3D 아키텍처와 관련된 제한된 데이터만 제공할 수 있습니다. 또한 이러한 3D 구조의 손상과 항원성 손실은 이러한 기술의 잘 알려진 부작용입니다.

이 기사의 현미경 검사를 위한 보완적인 새로운 프로토콜을 통해 여전히 하이드로겔에 있는 전체 마운트 샘플을 분석할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 면역조직화학용 용액(S-IHC)과 면역형광표지용 용액(S-IF)이라는 두 가지 새로 개발된 제형이 포함됩니다. 이러한 솔루션을 사용한 방법을 통해 연구원은 섬세한 구조의 원심분리, 피펫팅 및 이송과 같은 기존 워크플로의 유해한 영향이 없기 때문에 보다 정확한 데이터를 얻을 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 또한 수확, 차단, 제거 및 항원 검색 단계의 필요성을 제거하고 전체 절차를 6-8시간으로 단축합니다. 또한, 상기 방법론은 동일한 S-IF에 1 내지 3개의 항체를 동시에 첨가하는 것을 허용한다. 따라서 여러 표지 실험 후에도 같은 날에 결과를 얻을 수 있으며 이는 여기에 설명된 프로토콜의 또 다른 이점입니다. 기존의 전체 마운트 면역형광 표지 프로토콜은 일반적으로 3일에서 몇 주가 소요됩니다 10,11,12,13,14.

항원성을 감소시키는 또 다른 유해한 단계인 파라핀 임베딩도 생략됩니다. 3D 구조는 현미경 검사의 시작부터 끝까지 체외 환경에 남아 있습니다. 3D 구조가 성장 조건에 남아 있기 때문에 단백질 발현 및 위치 파악 데이터가 생체 내 조건을 더 잘 모방합니다. 이 방법론은 샘플의 항원 발현에 영향을 미치는 단계를 제거하기 때문에 더 정확한 결과가 예상됩니다. 표 1과 표 2는 이러한 새로운 프로토콜이 기존 워크플로에 비해 단계를 제거하고 실험실에서 시간과 노동력을 절약하며 비용과 폐기물을 줄이는 방법을 보여줍니다.

위에서 설명한 중요한 단계 외에도 또 다른 문제는 더 높은 세포 생존율 26,27,28,29,30,31로 샘플의 3D 구조를 보존하는 동결 보존 배지 및 방법을 제공하는 것입니다. 냉동 보존은 안정적인 모델 시스템을 만들고 오가노이드 및 스페로이드32,33의 바이오뱅킹을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 바이오 뱅킹 전체 원래 3D 구조는 건강 또는 질병의 자연 상태를보다 충실하게 요약 할 수 있습니다. 주요 고려 사항은 동결 보존의 편의성과 신뢰성 및 오가노이드/스페로이드의 해동입니다. 해동 후 오가노이드 회수율은 대부분의 최신 기술에서 매우 낮으며 종종 50% 미만입니다. 그러나 최근 연구에 따르면 생존율이26,27,28,29 향상되어 유망한 결과가 나타났습니다. Lee 등은 스페로이드 세포의 78%가 15% DMSO28을 함유한 위스콘신 대학 용액을 사용했을 때 동결보존 후 생존했음을 입증했습니다. 세포 생존율은 Arai et al.29의 연구에서 83 %로 증가했습니다. 그러나 동결 보존 후 결과는 3D 구조가 동일한 특성과 품질을 유지할 수 없기 때문에 크게 영향을받습니다. 또한 무혈청 시약은 제약 및 진단 환경에서 우수한 제조 관행에 필요합니다. 전통적인 워크플로우는 느린 냉동 방법을 위해 소 태아 혈청(FBS)과 디메틸설폭사이드(DMSO)가 포함된 배지를 사용하며, 둘 다 장애와 관련이 있습니다. FBS는 동물 유래 제품이며 배치 변형이 있을 수 있습니다. DMSO는 매우 성공적인 동결 방지제이지만 장기간 노출, 특히 해동 중에 세포 독성 효과를 유발할 수 있습니다30,31.

이 기사는 또한 하이드로겔에 있는 동안 전체 오가노이드 또는 스페로이드의 동결/해동 방법론에 대해 설명합니다. 이 연구에는 오가노이드 및 스페로이드 냉동을 위한 두 가지 공식이 사용되었습니다: (1) 전통적인 동결 용액(FS)을 함유한 10% DMSO 및 (2) 혈청 및 DMSO가 없는 동결 보존 배지. 이 동결 보존 배지에는 현재 공식과 다른 세포 외 기질 성분이 포함되어 있습니다. 세포외 기질은 거대분자, 프로테오글리칸 및 섬유질 단백질의 두 가지 주요 부류로 구성되며, 이는 세포 구성 요소에 대한 물리적 스캐폴딩에 필수적이지만 조직 형태 형성, 분화 및 항상성에 필요한 과정을 시작합니다. 34,35,36,37,38,39,40 . 콜라겐은 인장 강도를 제공하고, 세포 접착을 조절하고, 화학 주성 및 이동을 지원하고, 조직 발달을 지시합니다37. 또한, 엘라스틴 섬유는 반복적 인 스트레칭(38)을 겪는 조직에 반동을 제공한다. 제 3 섬유질 단백질인 피브로넥틴은 간질 세포외 기질의 조직을 지시하고, 세포 부착을 매개하는데 결정적인 역할을 하고, 세포외 메카노-조절자로서 기능한다(39). Du 등은 천연 악토미오신 모델 시스템41에 대한 닭 콜라겐 가수분해물의 동결보호 효과를 입증하였다. 그들의 결과는 콜라겐 가수 분해물이 얼음 결정 성장을 억제하고 상업용 동결 방지제와 유사하게 단백질 동결 변성 및 산화를 감소 시키며 동결-해동주기 후에 더 나은 겔 구조를 제공 할 수 있음을 시사합니다. 따라서 동결 보존 배지에 세포 외 매트릭스 성분을 추가하면 샘플에보다 안전하고 보호적인 환경을 제공하고 동결 - 해동 후 치유 할 수있는 살아있는 구조를 지원합니다.

또한, 본 연구는 살아있는 오가노이드 및 스페로이드의 세포질 막과 핵이 여전히 하이드로겔에 있는 동안 라벨링하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

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프로토콜

1. 오가노이드 및 스페로이드 배양

  1. 하이드로겔을 얼음 위에 밤새도록(냉장고 또는 차가운 방에서) 넣어 해동합니다.
  2. 시판되는 다목적 장치(MD; 재료 표 참조)를 실험 1일 전에 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 넣고 따뜻하게 한다.
  3. 멸균된 넓은 피펫 팁을 4°C의 냉장고에 넣습니다.
    참고: 1.1-1.3단계는 0일차에 수행되고 1.4-1.11단계는 1일에 수행됩니다.
  4. 하이드로겔을 층류 후드의 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
    1. 선택 사항 : 제조업체의 권장 사항에 따라 차가운 세포 배양 배지에서 하이드로 겔을 희석하십시오.
  5. HepG2 세포 펠릿 (상업적으로 입수 한 간세포 암종 세포주, 재료 표 참조)이 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  6. 예열된 장치의 틈새 내에 100% 하이드로겔 30-35μL를 플레이트하여 겔 방울을 만듭니다.
  7. 각 하이드로겔 방울의 상단 중앙에 10,000개의 HepG2 세포를 놓고(그림 2), 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  8. 하이드로겔 방울을 200μL의 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)와 10% 소 태아 혈청으로 덮습니다.
  9. 가스 흐름을 허용하기 위해 MD의 뚜껑을 올바른 위치에 덮고 장치를 인큐베이터에 놓습니다.
  10. 격일로 10% FBS가 포함된 200μL의 DMEM을 세포에 공급합니다.
  11. 도립 현미경으로 스페로이드의 성장을 확인합니다(그림 3). 스페로이드 형성은 3일 후에 시작됩니다. 비디오 1 은 하이드로겔 돔에서 다양한 수준의 스페로이드 위치를 보여줍니다.
    참고: 하이드로겔 주변의 액체를 부드럽게 흡입하고 하이드로겔 방울의 손상을 방지하기 위해 환경에 새 액체를 천천히 추가하는 것이 좋습니다.

2. 하이드로겔에서 전체 마운트 오가노이드/스페로이드의 헤마톡실린 및 에오신 염색

  1. 정착액을 따뜻하게 (4 % 파라 포름 알데히드; PFA), PBS, 및 헤마톡실린( 재료 표 참조)을 37°C로 하였다.
  2. 하이드로겔 방울을 둘러싼 배지를 피펫으로 흡인하고 고정할 4% PFA 100-200μL를 추가하고 37°C에서 15-20분 동안 배양합니다.
  3. 4% PFA를 흡인하고 PBS 200 μL를 첨가하여 37°C에서 각각 5분 동안 3회 세척한다. 이어서, PBS를 흡인하고, 200 μL의 헤마톡실린 용액과 함께 37°C에서 15-20분 동안 인큐베이션한다.
  4. 헤마톡실린을 흡인하고 200 μL의dH2O를 첨가하여 37°C에서 각각 10분 동안 3x 세척한다. dH2O를 흡인하고 37°C에서 5-10분 동안 200μL의 에탄올과 함께 인큐베이션한다.
  5. 에탄올을 흡인하고 200 μL의 Eosin( 재료 표 참조)과 함께 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 에오신 (Eosin)을 흡인하고 200 μL의dH 2O를 첨가하여 실온 (RT)에서 5 분 동안 세척한다.
  6. dH2O를 흡인하고 100 μL의 글리세롤을 첨가하여 하이드로겔 방울을 장착 매체로 덮는다.
  7. 선택 사항 : 커버 슬립으로 틈새를 장착하십시오. 이 단계는 상당한 크기의 오가노이드/스페로이드를 압착하는 것을 방지하기 위해 생략할 수 있습니다.
  8. 검사 때까지 건조되지 않도록 MD의 뚜껑을 단단히 닫으십시오. 샘플은 최소 6개월 동안 검사를 위해 안정적입니다.

3. 하이드로겔에서 전체 마운트 오가노이드/스페로이드의 면역조직화학

  1. 상업적으로 입수한 면역조직화학용 용액(S-IHC; 재료 표 참조)을 37°C로 가온한다.
  2. 하이드로겔 내의 오가노이드 또는 스페로이드를 200μL의 dH2O 중 3% 과산화수소 (H2O2)와 함께 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
  3. 과산화수소 용액을 흡입하고 37°C에서 5분 동안dH2O로 세척한다. dH2O를 흡인하고, 각각 10분 동안 37°C에서 100 μL의 S-IHC와 함께 2회 인큐베이션한다.
  4. S-IHC를 흡인하고 S-IHC에 희석된 100μL의 1차 항체( 재료 표 참조)와 함께 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다(작업 희석에 대한 제조업체의 권장 사항에 따름).
  5. 1차 항체 용액을 흡인하고, 100 μL의 S-IHC 3x와 함께 37°C에서 각각 5분 동안 인큐베이션한다.
  6. 100 μL의 S-IHC를 흡인하고, 37°C에서 10분 동안 비오티닐화된 2차 항체( 재료 표 참조)와 함께 인큐베이션한다.
  7. 2차 항체 용액을 흡인하고, 100 μL의 S-IHC 3x와 함께 37°C에서 각각 5분 동안 인큐베이션한다. S-IHC를 흡인하고, 100 μL의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 표지 된 스트렙타 비딘 ( 재료 표 참조)과 함께 37 °C에서 10 분 동안 배양한다.
  8. HRP 표지된 스트렙타비딘을 흡인하고, 100 μL의 S-IHC 3x와 함께 37°C에서 각각 5분 동안 인큐베이션한다.
  9. S-IHC를 흡인하고 100 μL의 DAB / AEC 크로 모겐 용액 혼합물 ( 재료 표 참조)과 함께 37 ° C에서 5-10 분 동안 배양합니다.
  10. 광학 현미경으로 염색의 강도를 모니터링하십시오.
  11. dH 2 O 3x로 각각2분 동안 세척하십시오.
  12. 선택 사항: 37°C에서 5분 동안 핵 대조염색을 위해 100μL의 헤마톡실린( 재료 표 참조)과 함께 배양합니다.
  13. 헤마톡실린을 흡입하고dH2O에서 5분 동안 세척한다.
  14. dH2O를 흡인하고 장착 매체로서 100 μL의 글리세롤로 하이드로겔 방울을 덮는다.
  15. 현미경 검사 때까지 MD의 뚜껑을 단단히 닫으십시오.
    참고: 항원 검색 및 단백질 차단 단계는 S-IHC가 이러한 단계를 제거하기 때문에 이 프로토콜에서 생략됩니다.

4. 하이드로겔에서 전체 마운트 오가노이드/스페로이드의 면역형광 표지

  1. 다음 물질을 37 ° C로 예열하십시오 : 4 % PFA, PBS, S-IF, S-IF 1 차 항체 용액, S-IF의 2 차 항체 용액, 핵 염색 및 글리세롤 ( 재료 표 참조).
  2. 세포 배양 배지를 흡인하고 37°C에서 15-30분 동안 200μL의 4% PFA로 고정합니다. 정착액을 흡인하고 37°C에서 각각 10분 동안 S-IF에서 3x 세척한다.
  3. 다음 단계에서 습도를 제공하기 위해 틈새를 둘러싸는면에 dH2O를 추가하십시오.
  4. 하이드로겔 방울을 둘러싸고 있는 S-IF를 흡인하고 하이드로겔 방울을 S-IF에서 100μL의 1차 항체 용액( 재료 표 참조)과 함께 37°C에서 30-60분 동안 배양합니다.
  5. 1차 항체 용액을 흡인하고 37°C에서 각각 10분 동안 S-IF 3x로 세척합니다.
  6. S-IF를 흡인하고 100μL의 2차 항체 용액( 재료 표 참조)과 함께 S-IF에서 37°C의 암실에서 30-60분 동안 배양합니다.
  7. 2차 항체 용액을 흡인하고, 암실에서 37°C에서 각각 10분 동안 PBS 3x로 세척한다.
  8. PBS를 흡인하고 장착 배지 또는 글리세롤을 포함하는 100μL의 핵-DNA 염색과 함께 어두운 곳에서 37°C에서 배양합니다.
  9. 건조를 피하기 위해 틈새를 글리세롤로 채 웁니다.
  10. 선택 사항 : 커버 슬립으로 틈새 시장을 덮으십시오. 이 단계는 오가노이드/스페로이드가 압착되는 것을 방지하기 위해 생략할 수 있습니다.
  11. MD를 단단히 닫습니다. MD의 샘플은 형광 손실을 최소화하면서 최소 6개월 동안 어둠 속에서 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  12. 컨포칼 현미경 검사에 다음 설정을 사용합니다: 모든 채널의 핀홀 값을 20.1로 설정하고, 게인 마스터를 488nm의 경우 550, 550nm의 경우 485, 594nm의 경우 450으로 일정하게 유지하고, 모든 실험에서 레이저 출력을 일정하게 유지하고, 최저 백분율을 2.0으로 유지합니다.
    참고: 1차 항체: 항-Na-K ATPase (1:100), 항-아르기나제 (1:50), 항-알부민 (1:50), 항-베타-갈락토시다아제 (1:25), 항미토콘드리아 항체 (1:100), 항골지 항체 (1:50), 항-사이토케라틴 5 (1:100), Ov6 항체 (1:100). 2 차 항체 : 염소 항 토끼 IgG (H + L) -488, 염소 항 토끼 IgG (H + L) -550, 염소 항 마우스 IgG (H + L) -488, 염소 항 마우스 IgG (H + L) -550, 염소 항 닭 IgY (H + L) -647. 모든 2차 항체에 대한 희석은 1:100이다. 또한 접합 항체인 FITC-팔로이딘(1:100)도 사용됩니다( 재료 표 참조).

5. 하이드로겔에서 살아있는 오가노이드와 스페로이드의 원형질막 및 핵 표지

  1. 제조업체의 권장 사항에 따라 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에 Alexa 불소 밀 배아 응집소(5.0μg/mL) 및 Hoechst(2μM)가 포함된 라벨링 용액을 준비하고 37°C까지 예열합니다.
  2. 세포 배양 배지를 흡인하고 100μL의 표지 용액을 추가하여 하이드로겔 방울을 덮습니다. 37°C에서 15-30분 동안 배양합니다.
  3. 표지 용액을 제거하고 PBS 2x에서 37°C에서 각각 10분 동안 2회 세척한다. 선택 사항: 200μL의 4% 포름알데히드로 37°C에서 15분 동안 고정합니다.
  4. 하이드로겔 방울을 장착 매체로서 글리세롤로 덮는다. 선택 사항 : 커버 유리로 틈새를 장착하십시오.
  5. MD의 뚜껑을 단단히 닫고 형광/컨포칼 현미경 검사가 있을 때까지 어두운 곳에서 냉장 보관하십시오. 적어도 6 개월 동안 안정적입니다.

6. 하이드로겔에서 전체 장착 오가노이드/스페로이드의 동결 및 해동

  1. 아래 단계에 따라 오가노이드를 동결합니다.
    1. 상업적으로 입수한 동결 용액(FS; 재료 표 참조)을 37°C로 예열한다.
    2. 하이드로겔 돔을 둘러싸고 있는 세포 배양 배지를 부드럽게 흡인합니다.
    3. FS 200μL를 부드럽게 추가합니다. 샘플을 FS와 함께 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.
    4. 장치의 뚜껑을 단단히 닫고 폼 상자에 넣습니다. 이 폼 상자를 보충 그림 3과 같이 다른 폼 상자에 넣습니다. 두 폼 상자를 단단히 닫습니다. 서로 내부에 있는 두 개의 폼 상자는 -20°C 냉동고에서 시료의 온도 냉각 구배 범위를 1 - 2°C/min으로 제공합니다.
    5. 상자를 -20°C에서 2시간 동안 놓습니다. 상자를 -80 ° C 냉동고로 옮기고 밤새 그대로 두십시오.
    6. 상자에서 샘플을 꺼냅니다. MD의 샘플은 -80 °C 냉동고에 6 개월 동안 보관할 수 있습니다.
    7. 장기 보관을 위해 샘플이 포함된 MD를 액체 질소 탱크로 옮깁니다.
  2. 아래 단계에 따라 오가노이드를 해동하십시오.
    1. 냉동고/질소 탱크에서 샘플이 포함된 MD를 꺼내 37°C의 인큐베이터에 직접 넣습니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    2. 200μL의 따뜻한 배양 배지를 틈새에 추가하고(FS와 세포 배양 배지의 비율은 1:1임) 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    3. 더 따뜻한 배양 배지를 틈새에 추가하고(FS 대 세포 배양 배지의 비율은 1:2임) 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    4. 배지와 FS 혼합물을 부드럽게 흡인합니다. 주사 전자 현미경 (7 단계) 및 투과 전자 현미경 (8 단계) 하이드로 겔에서 전체 마운트 오가노이드 / 스페로이드 이미징을 진행합니다.

7. 전체 장착 오가노이드/스페로이드의 주사 전자 현미경

  1. Karnovsky의 고정 및 고정 후 용액 ( 재료 표 참조)을 실온 (RT)으로 예열하십시오.
  2. MD에서 하이드로겔을 둘러싸고 있는 세포 배양 배지를 흡인한다. MD의 샘플을 층류 후드의 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
  3. 오가노이드/스페로이드를 둘러싸고 있는 액화된 하이드로겔을 매우 부드럽게 흡인합니다. 제한된 양의 matrigel은 샘플을 손상시키고 잃어 버리는 것을 피하기 위해 틈새 시장에 머무를 수 있습니다.
  4. Karnovsky의 정착액 (2.5 % PFA, 0.15M Cacodylate 완충액 중 2.5 % 글루 타르 알데히드 및 2mM CaCl2, 재료 표 참조)을 RT에서 1 시간 동안 고정하십시오.
  5. 정착액을 부드럽게 흡인하고 증류수(dH2O)로 각각 15분 동안 3회 세척합니다.
  6. dH2O를 부드럽게 흡입하고 RT에서 1시간 동안 고정 후 용액(1% 사산화오스뮴 수용액[OsO4], 재료 표 참조)으로 고정합니다.
  7. 정착액을 부드럽게 흡인하고 증류수(dH2O)로 각각 15분 동안 3회 세척합니다.
  8. 등급이 매겨진 일련의 에탄올 (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 100 %), 에탄올 / 아세톤의 혼합물 (1 : 1; 1 : 2) 및 RT에서 절대 아세톤을 각각 15 분 동안 탈수시킵니다.
  9. 임계점 건조기로 건조하십시오.
  10. 스퍼터 코터( 재료 표 참조)를 사용하여 장치의 시편을 6nm 금/팔라듐으로 90초 동안 코팅합니다.
  11. 렌즈 내 2 차 전자 검출기를 사용하여 주사 전자 현미경으로 진공 모드 (5 x 10-6 mA)에서 2-3 kV로 관찰하십시오. 작동 거리가 8.1-8.2mm이고 675x, 1050x 및 1570x 배율로 이미지를 촬영합니다.
    참고: 모든 단계는 MD에서 수행됩니다. 각 단계에 200-250 μL의 용액을 사용하십시오.

8. 하이드로겔에서 전체 장착 오가노이드/스페로이드의 투과 전자 현미경

  1. 카르노프스키의 정착액을 37°C로 예열합니다. MD에서 하이드로겔을 둘러싸고 있는 세포 배양 배지를 흡인한다.
  2. RT에서 Karnovsky의 정착액으로 샘플을 1 시간 동안 고정하십시오. dH2O 3x로 각각 15 분 동안 세척하십시오.
  3. RT에서 45 분 동안 2 % 수성 OsO4 및 2.5 % 칼륨 페로 시안화물로 사후 수정. dH2O 3x로 각각 10 분 동안 세척하십시오.
  4. RT에서 0.5 % 티오 카르 보 히드라 지드 (TCH, 재료 표 참조)에서 30 분 동안 배양합니다. dH2O 3x로 각각 10 분 동안 세척하십시오.
  5. RT에서 2% 수성OsO4에서 30분 동안 인큐베이션한다. dH2O 3x로 각각 10 분 동안 세척하십시오.
  6. RT에서 2 % 우라 닐 아세테이트 용액 ( 재료 표 참조)에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 이 단계에서 스페로이드는 밤새 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  7. 납 아스파르테이트 용액( 재료 표 참조)에서 60°C에서 45분 동안 배양합니다. dH2O 3x로 각각 10 분 동안 세척하십시오.
  8. 등급이 매겨진 일련의 에탄올 (50 %, 70 %, 90 %, 100 % [x2])과 절대 아세톤을 RT에서 각각 15 분 동안 탈수시킵니다.
  9. (1:1; 1:2) 아세톤/에폰 수지와 순수 에폰 수지( 재료 표 참조)의 혼합물로 RT에서 각각 2시간 동안 처리합니다.
  10. 수지를 60°C에서 밤새 중합합니다(최소 16시간). 중합 후, 보충 그림 4에 도시된 바와 같이 MD로부터 수지 블록을 제거한다.
  11. 수지 접착제로 수지 블록을 더 큰 블록에 부착하십시오. 블록을 다듬고 오가노이드 또는 스페로이드의 위치에 도달합니다.
  12. 울트라마이크로톰을 사용하여 반박형(1,000nm) 및 초박형 섹션(60nm)을 얻을 수 있습니다( 재료 표 참조).
  13. 초박형 섹션을 100 메쉬 구리 그리드에 놓고 STEM 검출기로 주사 전자 현미경으로 30kV의 가속 전압에서 관찰합니다. 44mm의 작동 거리와 2580x, 5020x 및 6060x 배율로 이미지를 캡처합니다.
    참고: 각 단계에 200-250μL의 용액을 사용하십시오. 8.1-8.10단계는 MD에서 수행됩니다.

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결과

본 논문은 고유하게 설계된 단일 환경에서 하이드로겔에 있는 동안 전체 오가노이드 또는 스페로이드의 배양, 냉동, 해동, 조직학적 염색, 면역조직화학 염색, 면역형광 라벨링, 코팅 및 처리를 위한 다목적 장치(MD) 및 보완 방법론을 나타냅니다. 현재 연구는 2 MD에서 35 개의 하이드로 겔 방울로 HepG35 간암 스페로이드를 준비하도록 설계되었습니다. 실험은 정확성을 보장하기 위해 삼중으로 수행되었습니다. 또한 MD의 폐 오가노이드는 오가노이드 연구에 대한 현재 방법론의 결과를 입증하기 위해 예로서 면역형광 표지되었습니다.

도 1 은 하이드로겔 돔을 포함하는 장치를 자세히 살펴본 것이다. 틈새의 크기와 모양은 오가노이드/스페로이드를 포함하는 하이드로겔을 보호하고 다양한 공정에서 사용되는 시약을 저장하도록 설계되었습니다. 또한, 틈새를 둘러싸고있는 장치의 측면 부분은 면역 염색 실험 중에 습도 챔버로서 사용될 수있다. 시료를...

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토론

여기에 설명된 제형 및 프로토콜을 보완하는 MD는 보다 통제된 환경에서 오가노이드 및 스페로이드의 빠르고 자발적인 3D 성장을 촉진하고 동일한 조건에서 실험을 계속합니다. 표본은 전체 프로세스 동안 동일한 환경에 유지되며 3D 성장 아키텍처의 거의 100%가 컨테이너에 그대로 유지됩니다. 이는 순차적 실험 동안 균질성을 향상시키고 연장된 배양 기간을 허용합니다. 또한 오가노이드 및 스페로이드 처리 중 단계 수가 기존 워크플로우에 비해 크게 감소하여(그림 4) 처리 시간과 인적 오류를 최소화하고 오염 위험을 줄입니다. 또한 실험 조건이 안정적으로 유지되는 동시에 단일 환경에서 3D 성장 구조를 보호하기 때문에 신뢰성과 타당성이 향상됩니다. 실험실에서 시간과 노동력을 절약하는 동시에 정확성, 신뢰성 및 유효성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 또한 전체 순차 프로세스 동안 개별 3D 성장 구조를 추적할 수 있습니다. 배양 중 크기 및 위치 변화와 다른 화합물에 대한 반응에 대한 검사...

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공개 사항

Ranan Gulhan Aktas는 MD, S-IHC, S-IF 및 FS 특허 출원을 소유하고 있습니다. Olgu Enis Tok은 이러한 제품의 개발에 참여했습니다. Olgu Enis Tok과 Gamze Demirel은 Cellorama라는 회사의 R & D 팀원입니다. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut 및 Ozgecan Kayalar는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

다이어그램 작성을 해준 시카고 대학교의 데일 메르테스(Dale Mertes), 이스탄불 메디폴 대학교 보건 과학 및 기술 연구소의 기술 지원을 해준 메흐메트 세리프 아이딘 박사, 원고 편집을 해준 말테페 대학교의 라나 카제미 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
절대 에탄올 (EtOH)Merck8187602500dH2O에 희석하여 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96% 용액을 만들어 RT
AcetoneMerck8222512500RT
Alexa fluor 밀 배아 응집소 및 Hoechst  Hank's Balanced Salt solution (HBSS)에 저장합니다.InvitrogenI34406Image-IT LIVE 플라즈마 멤브레인 및 핵 라벨링 키트, -20°C에서 보관; C
알파 -1 Fetoprotein (AFP) 농축 및 사전 희석 된 다클론 항체Biocare MedicalCP 028 A+4 °에 저장; C
항알부민 항체AbcamEPR20195+4 °에 저장; C, 희석 : 1:50
안티 베타 갈락토시다아제 항체, 닭 폴리 클로날Abcam 134435+4 °에서 저장; C, 희석 : 1:25
항 사이토케라틴 5Abcam53121+4 °에서 저장; C, 희석 : 1:100
Arginase-1 농축 및 사전 희석 토끼 단일 클론 항체Biocare MedicalACI 3058 A,B + 4 °에 저장; C, 희석: 1:50
염화칼슘 (CaCl2)SigmaC1016-500G를 Karnovsky의 정착제에 용해시켜 2 mM CaCl2를 만듭니다. RT에 저장
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
원심분리기 튜브, 15 mL Nest601051
원심분리기 튜브, 50 mL Nest602052
Class II 미생물 안전 캐비닛 Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 인큐베이터PanasonicKM-CC17RU2
구리 그리드전자 현미경 과학G100-Cu그리드에 배치된 초박형 섹션; 100라인/인치 정사각형 메쉬
임계점 건조기LeicaEM CPD300에서 SEM 응용 분야를 위한 생물학적 시료 건조용
 Sigma AldrichAEC101+4 매장 ° C
다이아몬드 나이프DiatomeUltra 45°, 40-US의 초박형 절편에 사용
분자 생물학용Biofroxx67-68-5
일회용 플라스틱 파스퇴르 PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029+4 °에서 저장; C
Eosin Y 솔루션 알코올 브라이트 슬라이드2.BS01-105-1000
Epon 수지 Sigma45359-1EA-F에폭시 임베딩 미디엄 키트, +4 °에서 보관; C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304+4 °에서 저장; C
동결 용액 (FS)CelloramaCellO-F+ 4 ° C
유리 칼 제작자LeicaEM KMR38mm 두께의
유리 칼 스트립 (크기 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08TEM
Glutaraldehyde 수용액, EM 등급, 25% Electron Microscopy Sciences16210dH2O에 희석하여 2.5% 용액을 만들고 +4°에서 저장합니다. C
글리세롤 용액Sigma Aldrich56-81-5-20 C에서 저장, 희석 : 1:100
염소 안티 닭 IgY (H + L) 2 차 항체, Alexa, 647InvitrogenA32933RT
저장 염소 안티 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체, DyLight, 488Invitrogen35502+4 °에서 저장; 씨,  희석 : 1:50
염소 안티 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체, DyLight, 550Invitrogen84540+4 °에서 저장; 씨,  희석 : 1:50
염소 항 토끼 IgG (H + L) 2 차 항체, DyLight, 488Invitrogen35552+4 °에서 저장; 씨,  희석 : 1:50
염소 항 토끼 IgG (H + L) 2 차 항체, DyLight, 550Invitrogen84541+4 °에서 저장; C
헤마톡실린 해리스 Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 세포ATCCHB-8065질소 탱크에 보관
Human/Rat OV-6 항체 단클론 마우스 IgG1 클론 # OV-6R& D SystemsMAB2020-20 °에서 보관; C
하이드로겔Corning354248Matrigel, 기저막 매트릭스 고농도(HC), LDEV-free, 10mL, -20°C에서 보관; C
하이드로겔Corning354234Matrigel, 기저막 매트릭스, LDEV-free, 10 mL, -20 °에서 보관; C
하이드로겔ThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R& D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, -20 °에서 보관; C
카르노프스키의 고정액%2 PFA, 0.15 M 카코딜레이트 완충액의 %2.5 글루타르알데히드, 2 mM CaCl2; 신선하게 준비; TEM & SEM 샘플
L-아스파르트산시그마11189-100GRT
리드 아스파르트산 용액40mg 아스파르트산을 10mL ddH2O에 용해시키고 66mg 질산납을 첨가합니다. 용액은 60°C에서 안정화됩니다. C를 선택하고 pH를 5로 조정하십시오. 새로운
질산납전자 현미경 과학17900RT 저장
Leica Confocal MicroscopeLeicaDMi8
LSM 700 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경Zeiss
Microplate readerBiotek Synergy
Multipurpose Device (MD)CelloramaCellO-M
핵-DNA 염색InvitrogenH3569Hoechst 33258, 펜타하이드레이트 (비스-벤즈이미드) - 10 mg/mL 용액, 물 저장, +4 ° C
핵-DNA 염색ThermoFischer Scientific62248DAPI 용액, +4 °에 보관; C
오스뮴 테트록사이드 (OsO4), 4%Electron Microscopy Sciences19190dH2O에 희석하여 2% 용액 만들기; +4 °에 저장; C와 밀폐된 용기에서; 가벼운
Ov6 항체R & D 시스템MAB2020+4 °에 저장; C
파라포름알데히드(PFA) 용액, 4% Sigma1.04005.10004% PFA를 dH2O에 용해시키고 끓여서 식히고 분취합니다. -20°C에서 보관하십시오.
C 파라 포름 알데히드 용액 4 % PBS, 1 L산타 크루즈 생명 공학sc-281692+4 °에서 저장; C
인산염 완충 식염수 (PBS), 정제MP Biomedicals, LLC2810305
Post-fixative solution%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; 새로운
Potassium Ferrocyanide 수용액 준비, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - 도립 명시야 현미경 - ZEISSZeiss번호: 491206-0001-000
둥근 바닥 마이크로 원심분리기 튜브, 2 mLNest620611
주사 전자 현미경, STEM 부착물ZeissGeminiSEM 500주사 전자 현미경 촬영을 위해 2-3kV의 Inlens Secondary Electron(SE) 검출기를 사용하고 투과 전자 현미경 촬영을 위해 30kV의 aSTEM 검출기를 사용합니다.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125+4 ° C
나트륨 카코딜레이트 완충액, 0.4 M, pH 7.2전자 현미경 과학11655dH2O에 희석하여 0.2 M를 만들고 +4°C에서 보관; C
나트륨/칼륨 ATPase alpha 1 항체 [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871-20 °에 저장;
C 면역형광 라벨링용 솔루션(S-IF)CelloramaCellO-IFStore at +4 >
C 면역조직화학을 위한 용액 (S-IHC)CelloramaCellO-PStore at +4 ° C
표본 트리밍 장치LeicaEM TRIM2epon 샘플 블록을 초박 분절기로
코팅 SEM 샘플을 6nm 금 / 팔라듐으로 90 초
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5GdH2< / sub>O로 희석하여 0.5 % 용액을 만들고 0.22 µ로 필터링합니다. M 멤브레인 필터; RT에 저장하십시오. 새로운
Trypan Blue Solution, 0.4 %Gibco15250061
Ultra gel super gluePattexPSG2C접착제 중합 epon 블록 홀더 epon 블록
UltramicrotomeLeicaEM UC7for composite ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µ LNest171215-1101
범용 피펫 팁, 1000 &마이크로; LIsolabL-002
범용 피펫 팁, 200 & 마이크로; 엘 둥지110919HA01
Uranyl 아세테이전자 현미경 과학22400dH2O에서 2% 용액을 만들고 0.22 &마이크로로 필터링합니다. M 멤브레인 필터; RT에서 단단히 닫힌 컨테이너 저장소를 유지하십시오
에 저장하고, 앱솔루트 아세톤 DAB/AEC 발색용액 혼합물 TEM Dimethyl sulfoxide의 유리 칼을 만드는 데 사용됩니다. 에 보관 아스파르트산 리드 용액 제품 초박 절개 스퍼터 코터 Leica EM ACE200 용 트 .

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