배양, 냉동, 처리 및 전체 오가노이드 및 스페로이드의 이미징 상태를 하이드로겔에 있는 동안

세포 연구 및 치료의 미래는 3D 세포 배양 ^1,2,3에 있습니다. 오가노이드 및 스페로이드 모델은 인체 발달, 생리학 및 질병 4,5,6,7,8,9 를 모방하는 더 나은 모델을 만들어 시험관 내 실험과 동물 모델 간의 격차를 좁힙니다. 그러나 이러한 모델의 재현성과 반복성은 여전히 어렵습니다. 또한 현재 기술로 이러한 구조를 취급, 수확, 이송 및 원심분리하면 많은 조건에서 오가노이드 및 스페로이드가 손실되거나 손상되어 결과에 큰 영향을 미칩니다.

조직학적 염색, 면역조직화학 염색, 면역형광 표지 및 동결보존을 위한 많은 프로토콜에도 불구하고 실험 조건을 표준화하고 이러한 섬세한 구조를 손실하거나 손상시키지 않고 취급 및 처리하는 것과 관련된 보편적인 접근 방식은 없습니다. 현재 프로토콜은 며칠에서 몇 주까지 번갈아 가며 엄청나게 길며 다양한 시약^{10,11,12,13,14}를 사용한 복잡한 절차를 포함합니다. 또한 세포 배양 용기와 냉동 비알 간의 3D 성장 구조를 수확, 피펫팅, 원심분리 및 이송하면 구조의 위치와 기계적 힘이 변경되고 궁극적으로 오가노이드 및 스페로이드의 분화 및 성숙에 영향을 미칩니다. 조직 토폴로지, 세포의 위치 및 기계적 힘이 세포 분화 및 성숙에 상당한 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다 6,15,16,17.

따라서, 현재의 종래식 기술을 개선하여 안정적인 품질의 오가노이드 및 스페로이드를 생성하는 것이 바람직하다. 위에서 설명한 원심분리 및 기타 단계를 건너뛰고 여러 공정의 시작부터 끝까지 단일 안전한 환경에서 재료를 제공하는 방법/장치는 가장 일관되고 신뢰할 수 있는 데이터에 도달하는 데 도움이 될 것입니다. 또한 시간, 노동 및 비용 제약을 줄일 수 있습니다.

여기에 설명된 다목적 장치(MD)는 오가노이드 및 스페로이드의 여러 공정을 위한 단일 안전 환경을 제공합니다(보충 그림 1). 이 장치와 보완 프로토콜은 수확, 피펫팅, 이송 및 원심분리 단계를 제거합니다. 오가노이드와 스페로이드는 순차적 과정 동안 시험관 내 환경에 남아 있습니다. 이 환경은 주로 상업적으로 이용 가능한 하이드로 겔과 같은 천연 또는 합성 세포 외 기질 성분으로 구성됩니다. 즉, 여기에 설명된 방법을 사용하면 오가노이드/스페로이드의 전체 장착 샘플을 하이드로겔 방울에 있는 동안 처리, 검사 및 냉동할 수 있습니다.

생체 적합성 장치는 60 ° C에서 -160 ° C 사이의 온도에 견딜 수 있으므로 -160 ° C의 액체 질소 탱크에서 유기체 / 스테로이드를 복원하거나 60 ° C에서 전자 현미경 용 수지 블록을 준비 할 수 있습니다. 이 장치의 틈새는 3D 성장 구조를 위한 제한된 공간을 정의하고 이전 연구 18,19,20,21,22,23을 기반으로 스페로이드 또는 오가노이드의 형성을 자극하도록 설계되었습니다. 장치의 해당 부분은 투명하며 높은 광학 품질을 제공하는 특정 플라스틱을 포함합니다(굴절률: 1.43, abbe 값: 58, 두께: 7.8mil[0.0078in 또는 198μm]). 틈새와 주변의 '측면'부분 모두자가 형광을 유발합니다. 중앙의 투명한 틈새는 80mm 2 면적이고 측면 부분은 600mm²입니다. 용기의 깊이는 15mm이고 두께는 1.5mm입니다. 이러한 기능은 장치의 크기와 디자인 외에도 다양한 유형의 첨단 현미경에서 관찰하고 전자 현미경 검사를 위해 샘플을 준비 할 수있게합니다 (그림 2). 장치의 폐쇄 시스템은 냉동실에 밀봉 된 위치와 인큐베이터에서 가스 흐름을 허용하는 두 가지 위치를 제공합니다. CCK8 증식 및 세포 독성 분석은 전통적인 세포 배양 접시와 비교하여 세포에 대한 유사한 효과를 보여줍니다 (보충 그림 2). 트리판 블루 배제 테스트는 MD에서 세포 배양 중 높은 세포 생존율(94%)을 보여줍니다(그림 3).

단일 장치에서 하나의 샘플에 대해 수행할 수 있는 공정은 (1) 배양, (2) 조직학적 염색, (3) 면역조직화학 및 면역형광 표지를 포함한 면역염색, (4) 동결, (5) 해동, (6) 명시야, 암시야, 형광, 공초점 및 초고해상도 현미경과 같은 광학 현미경으로 검사, (7) 주사 전자 현미경으로 직접 코팅 및 검사, 또는 (8) 투과 전자 현미경 준비( 그림 2).

조직학적 염색, 면역조직화학적 표지 또는 형광 표지 오가노이드 및 스페로이드 10,11,12,13,14,24,25에 대한 다양한 방법론이 존재합니다. 하이드로겔에서 이를 수확하는 것은 현재 기술의 첫 번째이자 주요 단계입니다. 이 단계 후에 일부 방법은 전체 마운트 면역 표지를 허용합니다. 수확된 오가노이드는 파라핀에 포매되고, 절편화되고, 다른 오가노이드의 염색 및 면역염색을 위해 표지됩니다. 그러나 섹션은 전체 샘플을 제공하지 않을 수 있으며 구조의 3D 아키텍처와 관련된 제한된 데이터만 제공할 수 있습니다. 또한 이러한 3D 구조의 손상과 항원성 손실은 이러한 기술의 잘 알려진 부작용입니다.

이 기사의 현미경 검사를 위한 보완적인 새로운 프로토콜을 통해 여전히 하이드로겔에 있는 전체 마운트 샘플을 분석할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 면역조직화학용 용액(S-IHC)과 면역형광표지용 용액(S-IF)이라는 두 가지 새로 개발된 제형이 포함됩니다. 이러한 솔루션을 사용한 방법을 통해 연구원은 섬세한 구조의 원심분리, 피펫팅 및 이송과 같은 기존 워크플로의 유해한 영향이 없기 때문에 보다 정확한 데이터를 얻을 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 또한 수확, 차단, 제거 및 항원 검색 단계의 필요성을 제거하고 전체 절차를 6-8시간으로 단축합니다. 또한, 상기 방법론은 동일한 S-IF에 1 내지 3개의 항체를 동시에 첨가하는 것을 허용한다. 따라서 여러 표지 실험 후에도 같은 날에 결과를 얻을 수 있으며 이는 여기에 설명된 프로토콜의 또 다른 이점입니다. 기존의 전체 마운트 면역형광 표지 프로토콜은 일반적으로 3일에서 몇 주가 소요됩니다 10,11,12,13,14.

항원성을 감소시키는 또 다른 유해한 단계인 파라핀 임베딩도 생략됩니다. 3D 구조는 현미경 검사의 시작부터 끝까지 체외 환경에 남아 있습니다. 3D 구조가 성장 조건에 남아 있기 때문에 단백질 발현 및 위치 파악 데이터가 생체 내 조건을 더 잘 모방합니다. 이 방법론은 샘플의 항원 발현에 영향을 미치는 단계를 제거하기 때문에 더 정확한 결과가 예상됩니다. 표 1과 표 2는 이러한 새로운 프로토콜이 기존 워크플로에 비해 단계를 제거하고 실험실에서 시간과 노동력을 절약하며 비용과 폐기물을 줄이는 방법을 보여줍니다.

위에서 설명한 중요한 단계 외에도 또 다른 문제는 더 높은 세포 생존율 26,27,28,29,30,31로 샘플의 ^3D 구조를 보존하는 동결 보존 배지 및 방법을 제공하는 것입니다. 냉동 보존은 안정적인 모델 시스템을 만들고 오가노이드 및 스페로이드^32,33의 바이오뱅킹을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 바이오 뱅킹 전체 원래 3D 구조는 건강 또는 질병의 자연 상태를보다 충실하게 요약 할 수 있습니다. 주요 고려 사항은 동결 보존의 편의성과 신뢰성 및 오가노이드/스페로이드의 해동입니다. 해동 후 오가노이드 회수율은 대부분의 최신 기술에서 매우 낮으며 종종 50% 미만입니다. 그러나 최근 연구에 따르면 생존율이^26,27,28,29 향상되어 유망한 결과가 나타났습니다. Lee 등은 스페로이드 세포의 78%가 15% DMSO²⁸을 함유한 위스콘신 대학 용액을 사용했을 때 동결보존 후 생존했음을 입증했습니다. 세포 생존율은 Arai et ^al.29의 연구에서 83 %로 증가했습니다. 그러나 동결 보존 후 결과는 3D 구조가 동일한 특성과 품질을 유지할 수 없기 때문에 크게 영향을받습니다. 또한 무혈청 시약은 제약 및 진단 환경에서 우수한 제조 관행에 필요합니다. 전통적인 워크플로우는 느린 냉동 방법을 위해 소 태아 혈청(FBS)과 디메틸설폭사이드(DMSO)가 포함된 배지를 사용하며, 둘 다 장애와 관련이 있습니다. FBS는 동물 유래 제품이며 배치 변형이 있을 수 있습니다. DMSO는 매우 성공적인 동결 방지제이지만 장기간 노출, 특히 해동 중에 세포 독성 효과를 유발할 수 있습니다^30,31.

이 기사는 또한 하이드로겔에 있는 동안 전체 오가노이드 또는 스페로이드의 동결/해동 방법론에 대해 설명합니다. 이 연구에는 오가노이드 및 스페로이드 냉동을 위한 두 가지 공식이 사용되었습니다: (1) 전통적인 동결 용액(FS)을 함유한 10% DMSO 및 (2) 혈청 및 DMSO가 없는 동결 보존 배지. 이 동결 보존 배지에는 현재 공식과 다른 세포 외 기질 성분이 포함되어 있습니다. 세포외 기질은 거대분자, 프로테오글리칸 및 섬유질 단백질의 두 가지 주요 부류로 구성되며, 이는 세포 구성 요소에 대한 물리적 스캐폴딩에 필수적이지만 조직 형태 형성, 분화 및 항상성에 필요한 과정을 시작합니다. 34,35,36,37,38,39,40 . 콜라겐은 인장 강도를 제공하고, 세포 접착을 조절하고, 화학 주성 및 이동을 지원하고, 조직 발달을 지시합니다³⁷. 또한, 엘라스틴 섬유는 반복적 인 스트레칭⁽³⁸)을 겪는 조직에 반동을 제공한다. 제 3 섬유질 단백질인 피브로넥틴은 간질 세포외 기질의 조직을 지시하고, 세포 부착을 매개하는데 결정적인 역할을 하고, 세포외 메카노-조절자로서 기능한다(³⁹). Du 등은 천연 악토미오신 모델 시스템⁴¹에 대한 닭 콜라겐 가수분해물의 동결보호 효과를 입증하였다. 그들의 결과는 콜라겐 가수 분해물이 얼음 결정 성장을 억제하고 상업용 동결 방지제와 유사하게 단백질 동결 변성 및 산화를 감소 시키며 동결-해동주기 후에 더 나은 겔 구조를 제공 할 수 있음을 시사합니다. 따라서 동결 보존 배지에 세포 외 매트릭스 성분을 추가하면 샘플에보다 안전하고 보호적인 환경을 제공하고 동결 - 해동 후 치유 할 수있는 살아있는 구조를 지원합니다.

또한, 본 연구는 살아있는 오가노이드 및 스페로이드의 세포질 막과 핵이 여전히 하이드로겔에 있는 동안 라벨링하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

1. 오가노이드 및 스페로이드 배양

1. 하이드로겔을 얼음 위에 밤새도록(냉장고 또는 차가운 방에서) 넣어 해동합니다.
2. 시판되는 다목적 장치(MD; 재료 표 참조)를 실험 1일 전에 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에 넣고 따뜻하게 한다.
3. 멸균된 넓은 피펫 팁을 4°C의 냉장고에 넣습니다.
   참고: 1.1-1.3단계는 0일차에 수행되고 1.4-1.11단계는 1일에 수행됩니다.
4. 하이드로겔을 층류 후드의 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
   1. 선택 사항 : 제조업체의 권장 사항에 따라 차가운 세포 배양 배지에서 하이드로 겔을 희석하십시오.
5. HepG2 세포 펠릿 (상업적으로 입수 한 간세포 암종 세포주, 재료 표 참조)이 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
6. 예열된 장치의 틈새 내에 100% 하이드로겔 30-35μL를 플레이트하여 겔 방울을 만듭니다.
7. 각 하이드로겔 방울의 상단 중앙에 10,000개의 HepG2 세포를 놓고(그림 2), 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
8. 하이드로겔 방울을 200μL의 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)와 10% 소 태아 혈청으로 덮습니다.
9. 가스 흐름을 허용하기 위해 MD의 뚜껑을 올바른 위치에 덮고 장치를 인큐베이터에 놓습니다.
10. 격일로 10% FBS가 포함된 200μL의 DMEM을 세포에 공급합니다.
11. 도립 현미경으로 스페로이드의 성장을 확인합니다(그림 3). 스페로이드 형성은 3^일 후에 시작됩니다. 비디오 1 은 하이드로겔 돔에서 다양한 수준의 스페로이드 위치를 보여줍니다.
    참고: 하이드로겔 주변의 액체를 부드럽게 흡입하고 하이드로겔 방울의 손상을 방지하기 위해 환경에 새 액체를 천천히 추가하는 것이 좋습니다.

2. 하이드로겔에서 전체 마운트 오가노이드/스페로이드의 헤마톡실린 및 에오신 염색

1. 정착액을 따뜻하게 (4 % 파라 포름 알데히드; PFA), PBS, 및 헤마톡실린( 재료 표 참조)을 37°C로 하였다.
2. 하이드로겔 방울을 둘러싼 배지를 피펫으로 흡인하고 고정할 4% PFA 100-200μL를 추가하고 37°C에서 15-20분 동안 배양합니다.
3. 4% PFA를 흡인하고 PBS 200 μL를 첨가하여 37°C에서 각각 5분 동안 3회 세척한다. 이어서, PBS를 흡인하고, 200 μL의 헤마톡실린 용액과 함께 37°C에서 15-20분 동안 인큐베이션한다.
4. 헤마톡실린을 흡인하고 200 μL의_dH2O를 첨가하여 37°C에서 각각 10분 동안 3x 세척한다. _dH2O를 흡인하고 37°C에서 5-10분 동안 200μL의 에탄올과 함께 인큐베이션한다.
5. 에탄올을 흡인하고 200 μL의 Eosin( 재료 표 참조)과 함께 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 에오신 (Eosin)을 흡인하고 200 μL의_{dH 2}O를 첨가하여 실온 (RT)에서 5 분 동안 세척한다.
6. _dH2O를 흡인하고 100 μL의 글리세롤을 첨가하여 하이드로겔 방울을 장착 매체로 덮는다.
7. 선택 사항 : 커버 슬립으로 틈새를 장착하십시오. 이 단계는 상당한 크기의 오가노이드/스페로이드를 압착하는 것을 방지하기 위해 생략할 수 있습니다.
8. 검사 때까지 건조되지 않도록 MD의 뚜껑을 단단히 닫으십시오. 샘플은 최소 6개월 동안 검사를 위해 안정적입니다.

3. 하이드로겔에서 전체 마운트 오가노이드/스페로이드의 면역조직화학

1. 상업적으로 입수한 면역조직화학용 용액(S-IHC; 재료 표 참조)을 37°C로 가온한다.
2. 하이드로겔 내의 오가노이드 또는 스페로이드를 200μL의 dH2O 중 3% 과산화수소 (_H2O2)와 함께 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
3. 과산화수소 용액을 흡입하고 37°C에서 5분 동안_dH2O로 세척한다. _dH2O를 흡인하고, 각각 10분 동안 37°C에서 100 μL의 S-IHC와 함께 2회 인큐베이션한다.
4. S-IHC를 흡인하고 S-IHC에 희석된 100μL의 1차 항체( 재료 표 참조)와 함께 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다(작업 희석에 대한 제조업체의 권장 사항에 따름).
5. 1차 항체 용액을 흡인하고, 100 μL의 S-IHC 3x와 함께 37°C에서 각각 5분 동안 인큐베이션한다.
6. 100 μL의 S-IHC를 흡인하고, 37°C에서 10분 동안 비오티닐화된 2차 항체( 재료 표 참조)와 함께 인큐베이션한다.
7. 2차 항체 용액을 흡인하고, 100 μL의 S-IHC 3x와 함께 37°C에서 각각 5분 동안 인큐베이션한다. S-IHC를 흡인하고, 100 μL의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 표지 된 스트렙타 비딘 ( 재료 표 참조)과 함께 37 °C에서 10 분 동안 배양한다.
8. HRP 표지된 스트렙타비딘을 흡인하고, 100 μL의 S-IHC 3x와 함께 37°C에서 각각 5분 동안 인큐베이션한다.
9. S-IHC를 흡인하고 100 μL의 DAB / AEC 크로 모겐 용액 혼합물 ( 재료 표 참조)과 함께 37 ° C에서 5-10 분 동안 배양합니다.
10. 광학 현미경으로 염색의 강도를 모니터링하십시오.
11. dH 2 O 3x로 각각₂분 동안 세척하십시오.
12. 선택 사항: 37°C에서 5분 동안 핵 대조염색을 위해 100μL의 헤마톡실린( 재료 표 참조)과 함께 배양합니다.
13. 헤마톡실린을 흡입하고_dH2O에서 5분 동안 세척한다.
14. _dH2O를 흡인하고 장착 매체로서 100 μL의 글리세롤로 하이드로겔 방울을 덮는다.
15. 현미경 검사 때까지 MD의 뚜껑을 단단히 닫으십시오.
    참고: 항원 검색 및 단백질 차단 단계는 S-IHC가 이러한 단계를 제거하기 때문에 이 프로토콜에서 생략됩니다.

4. 하이드로겔에서 전체 마운트 오가노이드/스페로이드의 면역형광 표지

1. 다음 물질을 37 ° C로 예열하십시오 : 4 % PFA, PBS, S-IF, S-IF 1 차 항체 용액, S-IF의 2 차 항체 용액, 핵 염색 및 글리세롤 ( 재료 표 참조).
2. 세포 배양 배지를 흡인하고 37°C에서 15-30분 동안 200μL의 4% PFA로 고정합니다. 정착액을 흡인하고 37°C에서 각각 10분 동안 S-IF에서 3x 세척한다.
3. 다음 단계에서 습도를 제공하기 위해 틈새를 둘러싸는면에 dH₂O를 추가하십시오.
4. 하이드로겔 방울을 둘러싸고 있는 S-IF를 흡인하고 하이드로겔 방울을 S-IF에서 100μL의 1차 항체 용액( 재료 표 참조)과 함께 37°C에서 30-60분 동안 배양합니다.
5. 1차 항체 용액을 흡인하고 37°C에서 각각 10분 동안 S-IF 3x로 세척합니다.
6. S-IF를 흡인하고 100μL의 2차 항체 용액( 재료 표 참조)과 함께 S-IF에서 37°C의 암실에서 30-60분 동안 배양합니다.
7. 2차 항체 용액을 흡인하고, 암실에서 37°C에서 각각 10분 동안 PBS 3x로 세척한다.
8. PBS를 흡인하고 장착 배지 또는 글리세롤을 포함하는 100μL의 핵-DNA 염색과 함께 어두운 곳에서 37°C에서 배양합니다.
9. 건조를 피하기 위해 틈새를 글리세롤로 채 웁니다.
10. 선택 사항 : 커버 슬립으로 틈새 시장을 덮으십시오. 이 단계는 오가노이드/스페로이드가 압착되는 것을 방지하기 위해 생략할 수 있습니다.
11. MD를 단단히 닫습니다. MD의 샘플은 형광 손실을 최소화하면서 최소 6개월 동안 어둠 속에서 4°C에서 보관할 수 있습니다.
12. 컨포칼 현미경 검사에 다음 설정을 사용합니다: 모든 채널의 핀홀 값을 20.1로 설정하고, 게인 마스터를 488nm의 경우 550, 550nm의 경우 485, 594nm의 경우 450으로 일정하게 유지하고, 모든 실험에서 레이저 출력을 일정하게 유지하고, 최저 백분율을 2.0으로 유지합니다.
    참고: 1차 항체: 항-Na-K ATPase (1:100), 항-아르기나제 (1:50), 항-알부민 (1:50), 항-베타-갈락토시다아제 (1:25), 항미토콘드리아 항체 (1:100), 항골지 항체 (1:50), 항-사이토케라틴 5 (1:100), Ov6 항체 (1:100). 2 차 항체 : 염소 항 토끼 IgG (H + L) -488, 염소 항 토끼 IgG (H + L) -550, 염소 항 마우스 IgG (H + L) -488, 염소 항 마우스 IgG (H + L) -550, 염소 항 닭 IgY (H + L) -647. 모든 2차 항체에 대한 희석은 1:100이다. 또한 접합 항체인 FITC-팔로이딘(1:100)도 사용됩니다( 재료 표 참조).

5. 하이드로겔에서 살아있는 오가노이드와 스페로이드의 원형질막 및 핵 표지

1. 제조업체의 권장 사항에 따라 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에 Alexa 불소 밀 배아 응집소(5.0μg/mL) 및 Hoechst(2μM)가 포함된 라벨링 용액을 준비하고 37°C까지 예열합니다.
2. 세포 배양 배지를 흡인하고 100μL의 표지 용액을 추가하여 하이드로겔 방울을 덮습니다. 37°C에서 15-30분 동안 배양합니다.
3. 표지 용액을 제거하고 PBS 2x에서 37°C에서 각각 10분 동안 2회 세척한다. 선택 사항: 200μL의 4% 포름알데히드로 37°C에서 15분 동안 고정합니다.
4. 하이드로겔 방울을 장착 매체로서 글리세롤로 덮는다. 선택 사항 : 커버 유리로 틈새를 장착하십시오.
5. MD의 뚜껑을 단단히 닫고 형광/컨포칼 현미경 검사가 있을 때까지 어두운 곳에서 냉장 보관하십시오. 적어도 6 개월 동안 안정적입니다.

6. 하이드로겔에서 전체 장착 오가노이드/스페로이드의 동결 및 해동

1. 아래 단계에 따라 오가노이드를 동결합니다.
   1. 상업적으로 입수한 동결 용액(FS; 재료 표 참조)을 37°C로 예열한다.
   2. 하이드로겔 돔을 둘러싸고 있는 세포 배양 배지를 부드럽게 흡인합니다.
   3. FS 200μL를 부드럽게 추가합니다. 샘플을 FS와 함께 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.
   4. 장치의 뚜껑을 단단히 닫고 폼 상자에 넣습니다. 이 폼 상자를 보충 그림 3과 같이 다른 폼 상자에 넣습니다. 두 폼 상자를 단단히 닫습니다. 서로 내부에 있는 두 개의 폼 상자는 -20°C 냉동고에서 시료의 온도 냉각 구배 범위를 1 - 2°C/min으로 제공합니다.
   5. 상자를 -20°C에서 2시간 동안 놓습니다. 상자를 -80 ° C 냉동고로 옮기고 밤새 그대로 두십시오.
   6. 상자에서 샘플을 꺼냅니다. MD의 샘플은 -80 °C 냉동고에 6 개월 동안 보관할 수 있습니다.
   7. 장기 보관을 위해 샘플이 포함된 MD를 액체 질소 탱크로 옮깁니다.
2. 아래 단계에 따라 오가노이드를 해동하십시오.
   1. 냉동고/질소 탱크에서 샘플이 포함된 MD를 꺼내 37°C의 인큐베이터에 직접 넣습니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 200μL의 따뜻한 배양 배지를 틈새에 추가하고(FS와 세포 배양 배지의 비율은 1:1임) 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   3. 더 따뜻한 배양 배지를 틈새에 추가하고(FS 대 세포 배양 배지의 비율은 1:2임) 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   4. 배지와 FS 혼합물을 부드럽게 흡인합니다. 주사 전자 현미경 (7 단계) 및 투과 전자 현미경 (8 단계) 하이드로 겔에서 전체 마운트 오가노이드 / 스페로이드 이미징을 진행합니다.

7. 전체 장착 오가노이드/스페로이드의 주사 전자 현미경

1. Karnovsky의 고정 및 고정 후 용액 ( 재료 표 참조)을 실온 (RT)으로 예열하십시오.
2. MD에서 하이드로겔을 둘러싸고 있는 세포 배양 배지를 흡인한다. MD의 샘플을 층류 후드의 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
3. 오가노이드/스페로이드를 둘러싸고 있는 액화된 하이드로겔을 매우 부드럽게 흡인합니다. 제한된 양의 matrigel은 샘플을 손상시키고 잃어 버리는 것을 피하기 위해 틈새 시장에 머무를 수 있습니다.
4. Karnovsky의 정착액 (2.5 % PFA, 0.15M Cacodylate 완충액 중 2.5 % 글루 타르 알데히드 및 2mM CaCl₂, 재료 표 참조)을 RT에서 1 시간 동안 고정하십시오.
5. 정착액을 부드럽게 흡인하고 증류수(_dH2O)로 각각 15분 동안 3회 세척합니다.
6. _dH2O를 부드럽게 흡입하고 RT에서 1시간 동안 고정 후 용액(1% 사산화오스뮴 수용액[_OsO4], 재료 표 참조)으로 고정합니다.
7. 정착액을 부드럽게 흡인하고 증류수(_dH2O)로 각각 15분 동안 3회 세척합니다.
8. 등급이 매겨진 일련의 에탄올 (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 100 %), 에탄올 / 아세톤의 혼합물 (1 : 1; 1 : 2) 및 RT에서 절대 아세톤을 각각 15 분 동안 탈수시킵니다.
9. 임계점 건조기로 건조하십시오.
10. 스퍼터 코터( 재료 표 참조)를 사용하여 장치의 시편을 6nm 금/팔라듐으로 90초 동안 코팅합니다.
11. 렌즈 내 2 차 전자 검출기를 사용하여 주사 전자 현미경으로 진공 모드 (5 x 10-6 mA)에서 ^2-3 kV로 관찰하십시오. 작동 거리가 8.1-8.2mm이고 675x, 1050x 및 1570x 배율로 이미지를 촬영합니다.
    참고: 모든 단계는 MD에서 수행됩니다. 각 단계에 200-250 μL의 용액을 사용하십시오.

8. 하이드로겔에서 전체 장착 오가노이드/스페로이드의 투과 전자 현미경

1. 카르노프스키의 정착액을 37°C로 예열합니다. MD에서 하이드로겔을 둘러싸고 있는 세포 배양 배지를 흡인한다.
2. RT에서 Karnovsky의 정착액으로 샘플을 1 시간 동안 고정하십시오. dH₂O 3x로 각각 15 분 동안 세척하십시오.
3. RT에서 45 분 동안 2 % 수성 OsO₄ 및 2.5 % 칼륨 페로 시안화물로 사후 수정. dH₂O 3x로 각각 10 분 동안 세척하십시오.
4. RT에서 0.5 % 티오 카르 보 히드라 지드 (TCH, 재료 표 참조)에서 30 분 동안 배양합니다. dH₂O 3x로 각각 10 분 동안 세척하십시오.
5. RT에서 2% 수성_OsO4에서 30분 동안 인큐베이션한다. dH₂O 3x로 각각 10 분 동안 세척하십시오.
6. RT에서 2 % 우라 닐 아세테이트 용액 ( 재료 표 참조)에서 1 시간 동안 배양하십시오.
   참고: 이 단계에서 스페로이드는 밤새 4°C에서 보관할 수 있습니다.
7. 납 아스파르테이트 용액( 재료 표 참조)에서 60°C에서 45분 동안 배양합니다. dH₂O 3x로 각각 10 분 동안 세척하십시오.
8. 등급이 매겨진 일련의 에탄올 (50 %, 70 %, 90 %, 100 % [x2])과 절대 아세톤을 RT에서 각각 15 분 동안 탈수시킵니다.
9. (1:1; 1:2) 아세톤/에폰 수지와 순수 에폰 수지( 재료 표 참조)의 혼합물로 RT에서 각각 2시간 동안 처리합니다.
10. 수지를 60°C에서 밤새 중합합니다(최소 16시간). 중합 후, 보충 그림 4에 도시된 바와 같이 MD로부터 수지 블록을 제거한다.
11. 수지 접착제로 수지 블록을 더 큰 블록에 부착하십시오. 블록을 다듬고 오가노이드 또는 스페로이드의 위치에 도달합니다.
12. 울트라마이크로톰을 사용하여 반박형(1,000nm) 및 초박형 섹션(60nm)을 얻을 수 있습니다( 재료 표 참조).
13. 초박형 섹션을 100 메쉬 구리 그리드에 놓고 STEM 검출기로 주사 전자 현미경으로 30kV의 가속 전압에서 관찰합니다. 44mm의 작동 거리와 2580x, 5020x 및 6060x 배율로 이미지를 캡처합니다.
    참고: 각 단계에 200-250μL의 용액을 사용하십시오. 8.1-8.10단계는 MD에서 수행됩니다.

본 논문은 고유하게 설계된 단일 환경에서 하이드로겔에 있는 동안 전체 오가노이드 또는 스페로이드의 배양, 냉동, 해동, 조직학적 염색, 면역조직화학 염색, 면역형광 라벨링, 코팅 및 처리를 위한 다목적 장치(MD) 및 보완 방법론을 나타냅니다. 현재 연구는 2 MD에서 35 개의 하이드로 겔 방울로 HepG35 간암 스페로이드를 준비하도록 설계되었습니다. 실험은 정확성을 보장하기 위해 삼중으로 수행되었습니다. 또한 MD의 폐 오가노이드는 오가노이드 연구에 대한 현재 방법론의 결과를 입증하기 위해 예로서 면역형광 표지되었습니다.

도 1 은 하이드로겔 돔을 포함하는 장치를 자세히 살펴본 것이다. 틈새의 크기와 모양은 오가노이드/스페로이드를 포함하는 하이드로겔을 보호하고 다양한 공정에서 사용되는 시약을 저장하도록 설계되었습니다. 또한, 틈새를 둘러싸고있는 장치의 측면 부분은 면역 염색 실험 중에 습도 챔버로서 사용될 수있다. 시료를 공급하는 배지는 하이드로겔 방울의 높이에 따라 100-200 μL 사이에서 달라질 수 있다. 현재 연구는 많은 하이드로겔, 상업용 세포외 기질 성분 및 기저막 추출물을 통해 사용자가 방울을 준비할 수 있기 때문에 돔 기반 방법에 중점을 둡니다. 그러나 MD의 틈새를 하이드로겔로 채운 다음 그 안에 세포를 시드하여 오가노이드/스페로이드를 생성하는 것도 가능합니다. 이 방법은 매트릭스의 점도가 돔의 준비를 허용하지 않거나 실험에 많은 양의 유기체가 포함 된 경우 선호 될 수 있습니다. 수액제 제조를 위한 하이드로겔 타입과 하이드로겔/배지 비율은 세포 타입, 실험 설계, 배지에 따라 달라질 수 있습니다. 그림 1  또한 명시야, 공초점 및 주사 전자 현미경에서 오가노이드/스페로이드를 조사할 수 있는 장치의 설계를 나타내며 오가노이드/스페로이드는 여전히 기본 체외 환경에 있습니다.

그림 2 는 하이드로겔에 세포를 시드하고 스페로이드 또는 오가노이드의 발달을 조사하는 방법을 보여줍니다. 다목적 장치의 디자인과 크기도 그 그림에 제시되었습니다. 비디오 1은 하이드로겔에서 3D 성장 스페로이드의 위치를 보여줍니다. 그림 3은 3일차부터 21일째까지 성장하는 스페로이드의 라이브 이미지를 나타냅니다. 스페로이드 및 오가노이드의 형성 시간은 샘플의 특성에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, HepG2 세포 및 HEK 세포의 스페로이드는 3일 이내에 형성되는 반면, 간 및 담즙 오가노이드의 형성은 실험 기간 동안 2주 동안 지속되었습니다.

헤마톡실린 및 에오신 염색 스페로이드는 그림 4에서 볼 수 있습니다. 이미지는 다양한 크기와 스페로이드의 융합에서 잘 보존되고 균질하게 염색된 스페로이드를 나타냅니다. 스페로이드 중앙의 살아있는 세포는 주목할 만합니다. 이 이미지는 또한 서로 다른 스페로이드의 세포 간의 섬세한 연결을 보여줍니다. 이러한 깨지기 쉬운 연결은 전송, 피펫팅 또는 원심분리가 손상될 수 있기 때문에 기존 워크플로 후에는 시각화할 수 없었습니다. 그림 5  간세포 암종42,43의 진단 및 예후를위한 가장 일반적인 마커 중 하나 인 Arginase에 특이 적 항체로 스페로이드의 면역 염색을 보여줍니다. 현미경 사진은 동일한 스페로이드에서 분화된 간암 세포와 미분화된 간암 세포를 보여줍니다. 이 그림에는 헤마톡실린으로 카운터 염색이 있거나없는 이미지가 포함되어 있습니다. 연구원은 3D 구조에서 표지된 영역을 구별하기 어려운 경우 Hematoxylin을 사용한 대조염색을 생략하도록 선택할 수 있습니다.

그림 6 은 하이드로겔에서 살아있는 오가노이드/스페로이드의 전체 마운트 시각화를 위한 또 다른 간단한 프로토콜인 생세포막 및 핵 염색을 나타냅니다. 이 방법론은 주변과 중심에서 동일한 라벨링 밀도를 허용하여 완전한 시약 침투를 보여줍니다. 그림 7, 그림 8 및 그림 9 는 각각 1개, 2개 또는 3개의 항체로 표지된 스페로이드의 대표 이미지를 보여줍니다. 1 내지 3개의 1차 항체를 S-IF에 동시에 희석한다. 유사하게, 실험에 적합한 1 내지 3개의 일치하는 2차 항체를 S-IF에 동시에 희석한다. 면역 표지 프로토콜을 통해 연구원은 3D 구조를 잃거나 손상시키지 않고 4-6시간 내에 표시할 수 있습니다. 배경은 투명하며 여기에 사용된 기술은 추가 제거, 항원 검색 또는 차단 방법/솔루션이 필요하지 않습니다. 이 방법을 통해 연구원은 한 번에 여러 항체로 표본을 라벨링 할 수 있습니다. 즉, 사용자는 1 내지 3개의 1차 항체를 함유하는 하나의 용액 및 1 내지 3개의 2차 항체와 매칭되는 또 다른 용액을 준비한다. 여기에 설명된 프로토콜은 종래의 방법론에서 상이한 항체를 갖는 순차적 표지 단계를 제거한다.

도 10 은 스페로이드의 주사 및 투과 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 첫 번째 행은 주사 전자 현미경으로 MD의 전체 스페로이드 사진을 보여줍니다. 두 번째 행에는 MD에서 전체 장착 스페로이드를 포함하는 수지 블록을 준비한 후 스페로이드의 투과 전자 현미경 이미지와 절편 및 염색된 스페로이드의 이미지가 포함되어 있습니다. 잘 보존된 세포질 소기관 및 세포의 기타 미세 구조적 특징은 전체 샘플의 3D 구조를 보호하는 이 간단한 프로토콜의 효과를 보여줍니다. MD는 또한 연구원들이 하이드로겔에서 전체 마운트 샘플을 동결 및 해동할 수 있도록 합니다. 그림 11  하이드로겔 돔과 스페로이드를 동결 전후의 더 높은 배율로 보여줍니다. 하이드로 겔 돔의 경계에서의 불규칙성은 주목할 만하다. 그러나 동결 보존 스페로이드의 진원도는 동결 전 스페로이드에 비해 해동 후 거의 안정적입니다. 살아있는 세포막 및 핵 표지 방법도 해동 후 48시간 후에 적용되어 동결/해동 절차가 3D 아키텍처, 세포막 및 세포 생존율에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다. 디메틸 설폭 시드를 함유 한 전통적인 동결 용액과 현재 새로 제형화 된 용액 인 SF는 유사한 결과를 보여줍니다. 3D 구조의 75 % 이상이이 프로토콜에서 생존 할 수 있습니다. 그러나 오가노이드 및 스페로이드에 대한 각 제형의 장기적인 부작용을 밝히기 위해서는 추가 실험이 필요합니다.

표 1 및 표 2는 단계 번호, 기간 및 폐기물 생성(즉, 각 워크플로우에 대한 총 비닐 장갑, 피펫 팁, 혈청학적 피펫, 원심분리 튜브, 미세 원심분리 튜브, 세포 배양 용기, 저온 비알 등)을 기반으로 기존 워크플로우를 여기에 설명된 워크플로우와 비교합니다.

보충 그림 1은 단일 MD에서 개략적으로 수행할 수 있는 순차적 단계를 나타냅니다. 보충 그림 2는 MD 또는 전통적인 유리 바닥 접시에서 HepG2 세포의 세포 생존율, 독성 및 증식 속도를 비교하도록 설계된 실험 결과를 보여줍니다. 보충 그림 3은 MD에서 샘플을 동결하는 데 사용된 폼 상자를 보여줍니다. 보충 그림 4는 MD에서 수지 블록을 꺼내는 단계를 요약한 것입니다. 보충 그림 5에는 면역형광 표지된 기도 오가노이드의 이미지가 포함되어 있으며 MD에 있는 동안 시각화되었습니다. 유사하게, 비디오 2는 MD에서 두 개의 면역형광 표지된 기도 오가노이드를 보여줍니다. 마지막으로, 보충 그림 6은 기존 워크플로우와 여기에 설명된 워크플로우를 사용하여 동결 전후의 살아있는 스페로이드에서 세포막 표지 강도의 평균 강도를 비교한 그래프입니다. 이미지 J 소프트웨어가 분석에 사용되었습니다.

그림 1: 다목적 세포 배양 장치(MD). (A) 장치의 중앙 부분인 틈새(N)는 순차적 공정 중에 하이드로겔 방울(D)에서 성장한 오가노이드/스페로이드에 대한 보호 환경을 조성하도록 설계되었습니다. 틈새의 주변 부분 인 측면 (S)은 면역 염색 실험 중에 가습기 챔버로 사용할 수 있습니다. (B) 뚜껑의 투명한 중앙을 통해 사용자는 장치를 닫을 때 오가노이드/스페로이드를 관찰할 수 있습니다. (c) MD에 오가노이드를 함유하는 하이드로겔 돔은 투과전자현미경을 위해 수지 블록에 염색되거나 매립될 수 있다. 뚜껑에는 행잉 드롭 방법론을 위한 틈새(N)도 포함되어 있습니다. 장치의 크기와 디자인을 통해 사용자는 (D) 명시야, (E) 공초점 및 (F) 주사 전자 현미경에서 오가노이드/스페로이드를 검사할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 하이드로겔 내부의 세포 파종. (A) 피펫의 셀 펠릿이 돔 상단에 삽입됩니다. 3-5 일 후, 스페로이드는 돔, 특히 방울 주변에서 볼 수 있습니다. (B) 돔에서 각 분기에서 성장하는 스페로이드의 라이브 이미지 4개를 캡처하고 병합했습니다. 스케일 바 = 200 μm. (C) 다목적 장치 (MD)의 설계 및 치수 (센티미터). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 3 일차부터 21일째까지 하이드로겔 방울에서 스페로이드 개발. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: MD 내에서 헤마톡실린 및 에오신 염색된 전체 마운트 스페로이드. 인접하거나 융합하는 스페로이드에 위치한 세포 간의 연결 시각화. 세포 사이의 섬세한 과정(화살표)은 하이드로겔의 전체 마운트 샘플이 3D 성장 구조를 손상시키지 않고 고정, 염색 및 검사되기 때문에 볼 수 있습니다. 스케일 바: 3일째, 9일째 = 50 μm; 7 일째, 17 일 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: MD 내 하이드로겔에서 전체 마운트 스페로이드의 면역조직화학적 염색. 샘플을 Arginase에 특이적인 항체로 면역염색하였다. Arginase 양성(빨간색 화살표) 및 음성(검은색 화살표) 세포가 스페로이드에서 보입니다. 이미지는 두 가지 실험에서 얻은 것입니다 : (A-C) 없음 및 (D-F) 헤 마톡 실린으로 카운터 염색. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 하이드로겔에서 살아있는 유기체의 컨포칼 이미지. 살아있는 오가노이드는 살아있는 세포막 (WGA) 및 핵 염색 (Hoechst)으로 표지되었다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 하나의 항체와 핵 염색(Hoechst)이 있는 하이드로겔에서 전체 장착 스페로이드의 면역형광 표지. (A-C) 상단 패널은 세포막에서 Na-K ATPase에 특이적인 항체로 표지된 스페로이드를 보여줍니다. (디에프) 하단 패널은 간암 스페로이드에서 간세포 암종에 특이적인 세포질 단백질인 Arginase에 특이적인 또 다른 항체의 위치를 보여줍니다. 염색 프로토콜의 지속 시간 : 6 시간. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 두 개의 항체와 핵 염색(Hoechst)이 있는 하이드로겔에서 전체 장착 스페로이드의 면역형광 표지. (A-C) 상부 패널은 알부민 및 Ov6에 특이적인 2개의 항체로 표지된 스페로이드를 나타낸다. 스케일 바 = 5 μm. (D-F) 하단 패널은 간암 스페로이드에서 알파 페토 단백질과 Ov6의 위치를 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. 염색 프로토콜의 지속 시간: 6 h. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 3개의 항체와 핵 염색(Hoechst)이 있는 하이드로겔에서 전체 장착 스페로이드의 면역형광 표지. (A-E) 상부 패널의 스페로이드는 아르기나제, Na-K ATPase 및 베타-갈락토시다제에 특이적인 항체로 표지되어 있습니다. 스케일 바 = 10 μm. (F-J) 중간 패널은 Ov6, 베타-갈락토시다아제 및 알파-페토 단백질로 표지된 스페로이드를 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. (K-O) 하단 패널의 스페로이드는 FITC-팔로이딘, 항미토콘드리아 항체 및 항골지 항체로 표지되어 있습니다. 스케일 바 = 20 μm. 높은 라벨링 특이성과 감소 된 배경에 주목하십시오. 염색 프로토콜의 지속 시간: 6 h. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 전자 현미경 이미지. (A-C) MD에서 하이드로겔 내의 전체 스페로이드의 주사 전자 현미경 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (DF) 스페로이드에서 세포의 미세 구조적 특징도 투과 전자 현미경으로 시각화되었습니다. 스케일 바 : (D) = 4 μm; (E, F) = 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: 동결 전후의 스페로이드의 라이브 이미지. (A-F) 하이드로 겔 돔의 경계의 불규칙성은 동결 후 분명합니다. 그러나 스페로이드의 크기와 진원도는 비슷합니다. (F) 해동 후 배양 표면상의 세포 이동을 볼 수 있습니다. (지엘) 살아있는 세포막(WGA)과 핵 염색(Hoechst)은 MD의 하이드로겔에서 전체 스페로이드를 동결하기 전과 후에 유사한 세포 생존율과 손상되지 않은 세포막을 보여줍니다. 스케일베이스 : (A, B, D, E) = 200 μm; (C, F, GL) = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 단기 실험 중 기존 워크플로와 새로운 워크플로 간의 단계 번호, 시간 및 폐기물 생산 비교.

표 2: 종래의 면역표지와 새로운 면역표지 프로토콜의 비교.

비디오 1: 도립 위상차 현미경으로 스페로이드를 포함하는 하이드로겔의 다양한 수준에서 시계열 이미지. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2: 사이토케라틴 5 및 DAPI에 대한 항체로 표지된 두 개의 기도 오가노이드의 3D 구조. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 실험 개요. 이 회로도는 하이드로겔에서 전체 마운트 오가노이드를 성장시키고 검사하기 위한 순차적인 실험 단계를 보여줍니다. 여기에 설명된 기술을 통해 다양한 현미경으로 오가노이드를 성장, 동결, 해동, 라벨링 및 검사할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 전통적인 유리 바닥 접시 또는 MD에서 HepG2 세포의 세포 생존율, 독성 및 증식 속도 비교. HepG2 세포를 (A) 전통적인 유리 바닥 세포 배양 접시 또는 (B) MD에서 성장시켜 세포 생존율과 독성을 비교했습니다. (c) 트리판 블루 배제 시험은 생존력을 입증하기 위해 사용되었다. 스케일 바 = 20 μm. 결과를 (D-E) CCK8 세포독성 및 (F) 세포 증식 분석을 사용하여 비교하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 두 개의 폼 상자 배열. 하나의 폼 상자는 MD의 전체 오가노이드 또는 스페로이드의 느린 동결 과정에서 다른 상자 내부에 배치됩니다. *는 두 개의 상자를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: 수지의 중합 후에 MD로부터 수지 블록을 제거하는 방법을 보여주는 단계. (A) 스페로이드 또는 오가노이드를 둘러싸는 수지 블록은 MD 틈새 내부에서 준비된 다음 중합됩니다. (B-D) 그런 다음 적절한 얇은 막대로 수지 블록을 밀어 틈새에서 제거합니다. (E) 다음으로 아래 플라스틱이있는 수지 블록을 제거합니다. (F-G) 마지막으로, 블록이 여전히 플라스틱에 부착되어있는 경우 핀셋을 분리하기 위해 한 쌍의 핀셋이 사용됩니다. (H) 블록을 얇게 절단할 준비가 되었습니다. 수지 블록(*)의 전체 장착 오가노이드 또는 스페로이드는 투과 전자 현미경을 위한 절편 준비가 되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 5: 면역형광 표지를 한 다음 MD에 있는 동안 시각화한 기도 오가노이드. (A-C) 상단 패널은 중앙 내강이있는 원형기도 유기체를 보여줍니다. 녹색은 오가노이드의 가장 바깥쪽 고리에서 사이토케라틴 5를 발현하는 기도 전구세포를 나타내고 파란색은 핵을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. (D-F) 하단 패널에는 (D) DAPI 및 (E) Alexa 488 필터에 있는 두 개의 나란히 있는 오가노이드의 3차원 이미지와 (F) 병합된 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 6: 세포의 살아있는 세포막에 대한 표지 밀도 비교. 그래프는 기존의 워크플로와 현재 채택된 워크플로를 사용하여 동결 전후의 스페로이드를 비교합니다. 분석은 Image J 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 약어: IntDen = 통합 밀도(선택한 스페로이드의 형광 강도). CTCF = 보정된 총 세포 형광. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Ranan Gulhan Aktas는 MD, S-IHC, S-IF 및 FS 특허 출원을 소유하고 있습니다. Olgu Enis Tok은 이러한 제품의 개발에 참여했습니다. Olgu Enis Tok과 Gamze Demirel은 Cellorama라는 회사의 R & D 팀원입니다. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut 및 Ozgecan Kayalar는 선언 할 이해 상충이 없습니다.