방법 논문

배양, 냉동, 처리 및 전체 오가노이드 및 스페로이드의 이미징 상태를 하이드로겔에 있는 동안

DOI:

10.3791/64563

⸱

2022년 12월 23일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

이 논문에서

요약

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본 연구는 다양한 현미경으로 전체 스페로이드 및 오가노이드를 배양, 냉동, 해동, 가공, 염색, 라벨링 및 검사하는 방법론을 설명하지만 다목적 장치 내의 하이드로겔에 그대로 유지됩니다.

초록

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세포 배양 실험실에서 3차원 성장 구조인 오가노이드와 스페로이드는 인체를 더 잘 모방하고 동물 연구에 비해 이점이 있기 때문에 2차원 배양 모델에 비해 우수한 모델로 점점 더 인식되고 있습니다. 그러나 이러한 연구는 일반적으로 재현성 및 일관성 문제에 직면합니다. 서로 다른 세포 배양 용기 간의 오가노이드 및 스페로이드 이동, 피펫팅 및 원심분리와 같은 긴 실험 과정에서 이러한 취약하고 깨지기 쉬운 3D 성장 구조는 종종 손상되거나 손실됩니다. 궁극적으로 3D 구조는 동일한 특성과 품질을 유지할 수 없기 때문에 결과에 큰 영향을 미칩니다. 여기에 설명된 방법은 이러한 스트레스가 많은 단계를 최소화하고 오가노이드 및 스페로이드가 다목적 장치의 하이드로겔에 있는 동안 처리 시퀀스 전반에 걸쳐 안전하고 일관된 환경을 보장합니다. 연구원들은 단일 다목적 장치를 사용하여 컨포칼에서 전자 현미경에 이르기까지 다양한 첨단 장비에서 오가노이드 또는 스페로이드의 구조를 성장, 냉동, 해동, 가공, 염색, 라벨링 및 검사할 수 있습니다. 이 기술은 연구의 재현성, 신뢰성 및 타당성을 개선하는 동시에 처리 중 3D 성장 구조에 대한 안정적이고 보호적인 환경을 유지합니다. 또한 스트레스가 많은 단계를 제거하면 취급 오류를 최소화하고 소요 시간을 줄이며 오염 위험을 줄일 수 있습니다.

서론

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세포 연구 및 치료의 미래는 3D 세포 배양 1,2,3에 있습니다. 오가노이드 및 스페로이드 모델은 인체 발달, 생리학 및 질병 4,5,6,7,8,9 를 모방하는 더 나은 모델을 만들어 시험관 내 실험과 동물 모델 간의 격차를 좁힙니다. 그러나 이러한 모델의 재현성과 반복성은 여전히 어렵습니다. 또한 현재 기술로 이러한 구조를 취급, 수확, 이송 및 원심분리하면 많은 조건에서 오가노이드 및 스페로이드가 손실되거나 손상되어 결과에 큰 영향을 미칩니다.

조직학적 염색, 면역조직화학 염색, 면역형광 표지 및 동결보존을 위한 많은 프로토콜에도 불구하고 실험 조건을 ....

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프로토콜

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1. 오가노이드 및 스페로이드 배양

  1. 하이드로겔을 얼음 위에 밤새도록(냉장고 또는 차가운 방에서) 넣어 해동합니다.
  2. 시판되는 다목적 장치(MD; 재료 표 참조)를 실험 1일 전에 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 넣고 따뜻하게 한다.
  3. 멸균된 넓은 피펫 팁을 4°C의 냉장고에 넣습니다.
    참고: 1.1-1.3단계는 0일차에 수행되고 1.4-1.11단계는 1일에 수행됩니다.
  4. 하이드로겔을 층류 후드의 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.
    1. 선택 사항 : 제조업체의 권장 사항에 따라 차가운 세포 배양 배지에서 하이드로 겔을 희석하십시오.
  5. HepG2 세포 펠릿 (상업적으로 입수 한 간세포 암종 세포주, 재료 표 참조)이 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  6. 예열된 장치의 틈새 내에 100% 하이드로겔 30-35μL를 플레이트하여 겔 방울을 만듭니다.
  7. 각 하이드로겔 방울의 상단 중앙에 10,000개의 HepG2 세포를 놓고(그림 2), 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
    8. <....

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결과

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본 논문은 고유하게 설계된 단일 환경에서 하이드로겔에 있는 동안 전체 오가노이드 또는 스페로이드의 배양, 냉동, 해동, 조직학적 염색, 면역조직화학 염색, 면역형광 라벨링, 코팅 및 처리를 위한 다목적 장치(MD) 및 보완 방법론을 나타냅니다. 현재 연구는 2 MD에서 35 개의 하이드로 겔 방울로 HepG35 간암 스페로이드를 준비하도록 설계되었습니다. 실험은 정확성을 보장하기 위해 삼중으로 수행되었습니다. 또한 MD의 폐 오가노이드는 오가노이드 연구에 대한 현재 방법론의 결과를 입증하기 위해 예로서 면역형광 표지되었습니다.

도 1 은 하이드로겔 돔을 포함하는 장치를 자세히 살펴본 것이다. 틈새의 크기와 모양은 오가노이드/스페로이드를 포함하는 하이드로겔을 보호하고 다양한 공정에서 사용되는 시약을 저장하도록 설계되었습니다. 또한, 틈새를 둘러싸고있는 장치의 측면 부분은 면역 염색 실험 중에 습도 챔버로서 사용될 수있다. 시료를.......

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토론

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여기에 설명된 제형 및 프로토콜을 보완하는 MD는 보다 통제된 환경에서 오가노이드 및 스페로이드의 빠르고 자발적인 3D 성장을 촉진하고 동일한 조건에서 실험을 계속합니다. 표본은 전체 프로세스 동안 동일한 환경에 유지되며 3D 성장 아키텍처의 거의 100%가 컨테이너에 그대로 유지됩니다. 이는 순차적 실험 동안 균질성을 향상시키고 연장된 배양 기간을 허용합니다. 또한 오가노이드 및 스페로이드 처리 중 단계 수가 기존 워크플로우에 비해 크게 감소하여(그림 4) 처리 시간과 인적 오류를 최소화하고 오염 위험을 줄입니다. 또한 실험 조건이 안정적으로 유지되는 동시에 단일 환경에서 3D 성장 구조를 보호하기 때문에 신뢰성과 타당성이 향상됩니다. 실험실에서 시간과 노동력을 절약하는 동시에 정확성, 신뢰성 및 유효성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 또한 전체 순차 프로세스 동안 개별 3D 성장 구조를 추적할 수 있습니다. 배양 중 크기 및 위치 변화와 다른 화합물에 대한 반응에 대한 검사.......

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공개 사항

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Ranan Gulhan Aktas는 MD, S-IHC, S-IF 및 FS 특허 출원을 소유하고 있습니다. Olgu Enis Tok은 이러한 제품의 개발에 참여했습니다. Olgu Enis Tok과 Gamze Demirel은 Cellorama라는 회사의 R & D 팀원입니다. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut 및 Ozgecan Kayalar는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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다이어그램 작성을 해준 시카고 대학교의 데일 메르테스(Dale Mertes), 이스탄불 메디폴 대학교 보건 과학 및 기술 연구소의 기술 지원을 해준 메흐메트 세리프 아이딘 박사, 원고 편집을 해준 말테페 대학교의 라나 카제미 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
절대 에탄올 (EtOH)Merck8187602500dH2O에 희석하여 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96% 용액을 만들어 RT
AcetoneMerck8222512500RT
Alexa fluor 밀 배아 응집소 및 Hoechst  Hank's Balanced Salt solution (HBSS)에 저장합니다.InvitrogenI34406Image-IT LIVE 플라즈마 멤브레인 및 핵 라벨링 키트, -20°C에서 보관; C
알파 -1 Fetoprotein (AFP) 농축 및 사전 희석 된 다클론 항체Biocare MedicalCP 028 A+4 °에 저장; C
항알부민 항체AbcamEPR20195+4 °에 저장; C, 희석 : 1:50
안티 베타 갈락토시다아제 항체, 닭 폴리 클로날Abcam 134435+4 °에서 저장; C, 희석 : 1:25
항 사이토케라틴 5Abcam53121+4 °에서 저장; C, 희석 : 1:100
Arginase-1 농축 및 사전 희석 토끼 단일 클론 항체Biocare MedicalACI 3058 A,B + 4 °에 저장; C, 희석: 1:50
염화칼슘 (CaCl2)SigmaC1016-500G를 Karnovsky의 정착제에 용해시켜 2 mM CaCl2를 만듭니다. RT에 저장
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
원심분리기 튜브, 15 mL Nest601051
원심분리기 튜브, 50 mL Nest602052
Class II 미생물 안전 캐비닛 Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 인큐베이터PanasonicKM-CC17RU2
구리 그리드전자 현미경 과학G100-Cu그리드에 배치된 초박형 섹션; 100라인/인치 정사각형 메쉬
임계점 건조기LeicaEM CPD300에서 SEM 응용 분야를 위한 생물학적 시료 건조용
 Sigma AldrichAEC101+4 매장 ° C
다이아몬드 나이프DiatomeUltra 45°, 40-US의 초박형 절편에 사용
분자 생물학용Biofroxx67-68-5
일회용 플라스틱 파스퇴르 PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029+4 °에서 저장; C
Eosin Y 솔루션 알코올 브라이트 슬라이드2.BS01-105-1000
Epon 수지 Sigma45359-1EA-F에폭시 임베딩 미디엄 키트, +4 °에서 보관; C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304+4 °에서 저장; C
동결 용액 (FS)CelloramaCellO-F+ 4 ° C
유리 칼 제작자LeicaEM KMR38mm 두께의
유리 칼 스트립 (크기 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08TEM
Glutaraldehyde 수용액, EM 등급, 25% Electron Microscopy Sciences16210dH2O에 희석하여 2.5% 용액을 만들고 +4°에서 저장합니다. C
글리세롤 용액Sigma Aldrich56-81-5-20 C에서 저장, 희석 : 1:100
염소 안티 닭 IgY (H + L) 2 차 항체, Alexa, 647InvitrogenA32933RT
저장 염소 안티 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체, DyLight, 488Invitrogen35502+4 °에서 저장; 씨,  희석 : 1:50
염소 안티 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체, DyLight, 550Invitrogen84540+4 °에서 저장; 씨,  희석 : 1:50
염소 항 토끼 IgG (H + L) 2 차 항체, DyLight, 488Invitrogen35552+4 °에서 저장; 씨,  희석 : 1:50
염소 항 토끼 IgG (H + L) 2 차 항체, DyLight, 550Invitrogen84541+4 °에서 저장; C
헤마톡실린 해리스 Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 세포ATCCHB-8065질소 탱크에 보관
Human/Rat OV-6 항체 단클론 마우스 IgG1 클론 # OV-6R& D SystemsMAB2020-20 °에서 보관; C
하이드로겔Corning354248Matrigel, 기저막 매트릭스 고농도(HC), LDEV-free, 10mL, -20°C에서 보관; C
하이드로겔Corning354234Matrigel, 기저막 매트릭스, LDEV-free, 10 mL, -20 °에서 보관; C
하이드로겔ThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R& D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, -20 °에서 보관; C
카르노프스키의 고정액%2 PFA, 0.15 M 카코딜레이트 완충액의 %2.5 글루타르알데히드, 2 mM CaCl2; 신선하게 준비; TEM & SEM 샘플
L-아스파르트산시그마11189-100GRT
리드 아스파르트산 용액40mg 아스파르트산을 10mL ddH2O에 용해시키고 66mg 질산납을 첨가합니다. 용액은 60°C에서 안정화됩니다. C를 선택하고 pH를 5로 조정하십시오. 새로운
질산납전자 현미경 과학17900RT 저장
Leica Confocal MicroscopeLeicaDMi8
LSM 700 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경Zeiss
Microplate readerBiotek Synergy
Multipurpose Device (MD)CelloramaCellO-M
핵-DNA 염색InvitrogenH3569Hoechst 33258, 펜타하이드레이트 (비스-벤즈이미드) - 10 mg/mL 용액, 물 저장, +4 ° C
핵-DNA 염색ThermoFischer Scientific62248DAPI 용액, +4 °에 보관; C
오스뮴 테트록사이드 (OsO4), 4%Electron Microscopy Sciences19190dH2O에 희석하여 2% 용액 만들기; +4 °에 저장; C와 밀폐된 용기에서; 가벼운
Ov6 항체R & D 시스템MAB2020+4 °에 저장; C
파라포름알데히드(PFA) 용액, 4% Sigma1.04005.10004% PFA를 dH2O에 용해시키고 끓여서 식히고 분취합니다. -20°C에서 보관하십시오.
C 파라 포름 알데히드 용액 4 % PBS, 1 L산타 크루즈 생명 공학sc-281692+4 °에서 저장; C
인산염 완충 식염수 (PBS), 정제MP Biomedicals, LLC2810305
Post-fixative solution%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; 새로운
Potassium Ferrocyanide 수용액 준비, 5% Electron Microscopy Sciences26603-01Store at RT
Primovert - 도립 명시야 현미경 - ZEISSZeiss번호: 491206-0001-000
둥근 바닥 마이크로 원심분리기 튜브, 2 mLNest620611
주사 전자 현미경, STEM 부착물ZeissGeminiSEM 500주사 전자 현미경 촬영을 위해 2-3kV의 Inlens Secondary Electron(SE) 검출기를 사용하고 투과 전자 현미경 촬영을 위해 30kV의 aSTEM 검출기를 사용합니다.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab PackScyTek LaboratoriesSHP125+4 ° C
나트륨 카코딜레이트 완충액, 0.4 M, pH 7.2전자 현미경 과학11655dH2O에 희석하여 0.2 M를 만들고 +4°C에서 보관; C
나트륨/칼륨 ATPase alpha 1 항체 [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871-20 °에 저장;
C 면역형광 라벨링용 솔루션(S-IF)CelloramaCellO-IFStore at +4 >
C 면역조직화학을 위한 용액 (S-IHC)CelloramaCellO-PStore at +4 ° C
표본 트리밍 장치LeicaEM TRIM2epon 샘플 블록을 초박 분절기로
코팅 SEM 샘플을 6nm 금 / 팔라듐으로 90 초
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma223220-5GdH2< / sub>O로 희석하여 0.5 % 용액을 만들고 0.22 µ로 필터링합니다. M 멤브레인 필터; RT에 저장하십시오. 새로운
Trypan Blue Solution, 0.4 %Gibco15250061
Ultra gel super gluePattexPSG2C접착제 중합 epon 블록 홀더 epon 블록
UltramicrotomeLeicaEM UC7for composite ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µ LNest171215-1101
범용 피펫 팁, 1000 &마이크로; LIsolabL-002
범용 피펫 팁, 200 & 마이크로; 엘 둥지110919HA01
Uranyl 아세테이전자 현미경 과학22400dH2O에서 2% 용액을 만들고 0.22 &마이크로로 필터링합니다. M 멤브레인 필터; RT에서 단단히 닫힌 컨테이너 저장소를 유지하십시오
에 저장하고, 앱솔루트 아세톤 DAB/AEC 발색용액 혼합물 TEM Dimethyl sulfoxide의 유리 칼을 만드는 데 사용됩니다. 에 보관 아스파르트산 리드 용액 제품 초박 절개 스퍼터 코터 Leica EM ACE200 용 트 .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R.

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