이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

부유 기반 T 세포 분리, 활성화 및 마이크로버블을 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 샘플로부터의 확장

3.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64573

⸱

2022년 12월 23일

 ,  ,  , 
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

이 논문에서

요약

이 연구의 목적은 일차 인간 T 세포를 분리, 활성화 및 확장하기 위한 부유 기반 분리의 타당성을 입증하는 것입니다.

초록

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 T 세포를 분리하여 생체 외 배양을 확립하는 과정은 연구, 임상 테스트 및 세포 기반 치료에 매우 중요합니다. 이 연구에서, 생체외 PBMCs로부터 T 세포를 분리, 활성화 및 확장하기 위한 간단하고 신규한 프로토콜이 제시된다. 이 연구는 기능화 된 부력 활성화 세포 분류 (BACS) 기술을 활용하여 T 세포를 분리하고 활성화합니다. 간단히 말해서, 이 프로토콜은 백혈구 유래 PBMC에서 CD3+ 세포의 양성 선택을 포함하고, 24웰 플레이트에서 형질도입하기 전에 사전 접합된 항-CD28 결합 스트렙타비딘 마이크로버블(SAMB)을 사용한 48시간 공동 자극을 포함합니다. 기능화된 마이크로버블은 세포를 부력적으로 활성화할 수 있는 독특한 기회를 제공하여 최소한의 피로로 확장을 허용하는 증식성 표현형을 유도합니다. 이 기술은 공동 자극 마이크로 버블이 부력을 유지하고 배양 배지의 상단으로 돌아가기 때문에 피로를 줄여 팽창 세포가 공동 자극 인자와 접촉하는 시간을 줄입니다. 상기 결과는 단리되고 배양된 T 세포가 활성화 및 증식하기에 충분한 자극을 받지만 과도한 PD-1의 존재에 의해 입증된 바와 같이, 과잉활성화로 이어지는 과활성화로 이어지는 정도는 아님을 나타낸다.

서론

현재 전 세계적으로 500개 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 치료 임상 시험이 진행 중이며 4개의 CAR-T 세포 치료제품이 시판되고 있습니다1. 그러나, 이러한 잠재적 치유 요법 2,3,4,5의 효능, 확장성 및 장기적인 성공을 개선하기 위해 해결되어야 하는 수많은 CAR-T 세포 연구 및 제조 요구가 여전히 존재한다. 입양 CAR-T 세포 임상 연구 및 제조는 말초 혈액 샘플로부터 T 세포를 분리하고 분리된 세포의 후속 자극, 형질도입 및 확장으로 시작됩니다. T 세포 회수, 순도 및 활성화/고갈 신호와 같은 파라미터는 CAR-T 세포 연구 및 제조 3,4,6을 위한 세포 분리 및 자극 기술을 선택할 때 신중한 고려가 필요합니다. 중요하게도, 치료 효능을 향상시키기 위해서는 T 세포 고갈과 같은 현재 제조 공정으로부터 발생하는 생물학적 장애를 최소화함으로써 CAR-T 세포 요법의 치료 지속성을 개선할 필요가 있다6,7.

형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 자기 활성화 세포 분류(MACS)와 같은 기존 세포 분리 방법의 대안으로 여기에서 T 세포 분리를 위한 마이크로버블을 사용한 부력 활성화 세포 분류(BACS)가 시연됩니다. 마이크로버블 분리는 부력, 중공 마이크로스피어(마이크로버블)를 사용하여 타겟을 결합하고 유체 샘플(8,9)의 표면에 부유시킨다. 마이크로버블을 항체 (즉, 항-CD3)로 기능화함으로써, 목적하는 T 세포 집단을 말초 혈액 샘플로부터 양성으로 선택할 수 있다. 이어서, 현탁액에서 양성으로 선택된 T 세포를 공동-자극하고 활성화시키기 위한 항체-작용화된 마이크로버블 (즉, 항-CD28)의 상이한 집단의 사용이 본 연구에서 입증된다. 마이크로버블은 단순하고 고도로 조정 가능한 분리 및 활성화 워크플로우를 제공하여 부유 세포 배양 및 유전자 변형 및 확장과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있는 T 세포를 생성합니다. 비판적으로, 마이크로버블을 이용한 부력 세포 활성화는 억제된 세포 자극을 촉진하여 과도한 T 세포 고갈을 방지합니다7.

이 연구에서 유세포 분석은 기능화 된 마이크로 버블의 분리, 활성화 및 형질 도입 성공을 분석하고 형질 도입 후 성장 및 확장 단계에서 존재하는 특정 하위 집단에 대한 자세한 정보를 제공하는 데 사용되는 주요 도구였습니다. 유세포분석 외에도 명시야 및 형광 현미경을 사용하여 세포 건강, 형태 및 형질도입 성공을 확인했습니다. 이러한 결과를 바탕으로 마이크로버블 기술 및 프로토콜은 현재 사용되는 기존의 분리 및 활성화 방법에 대한 보다 조정 가능하고 부드러운 대안을 제공합니다. 특히, 마이크로버블-활성화된 세포는 산업 표준 도구 및 키트에서 전형적으로 관찰되는 것보다 T 세포 고갈 마커의 발현이 현저히 낮게 나타난다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 양성 선택을 이용한 마이크로버블로 T 세포 분리

참고: 이 프로토콜은 SAMB를 사용하는 소규모 CD3+ 양성 선택 접근 방식을 자세히 설명합니다.

  1. 100만 세포당 항체 25ng(25ng/M) 농도의 비오틴화 항-CD3(OKT3) 항체와 함께 2.5mL의 분리 완충액에 3 x 10 8개의 상업적으로 입수한PBMC 를 배양합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
  2. 스트렙타비딘 마이크로버블(SAMB)을 제조업체에서 보고한 SAMB 농도에 따라 0.5(SAMB 수량):1(세포 수량)의 비율로 추가합니다.
  3. 상업용 EOE(엔드 오버 엔드) 회전 장치를 사용하여 20rpm에서 실온에서 10-15분 동안 혼합합니다. 실온에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  4. 원심분리 후, 양성으로 선택된 세포는 SAMB와 함께 현탁액의 맨 위에 놓일 것입니다. 선택되지 않은 나머지 세포는 튜브 바닥의 셀 펠릿에 있습니다. 9인치 유리 피펫을 사용하여 버블 셀 층 아래의 팁을 튜브 바닥에 삽입하고 전자 피펫으로 세포 펠릿과 부탄산액을 흡입하여 새 튜브로 옮깁니다.

2. 양성으로 선택된 T 세포의 공동 자극 (활성화)

  1. 원래 튜브에 남아 있는 버블 세포 층을 1mL의 완전한 T 세포 배지(또는 다른 원하는 배지)에 재현탁합니다.
  2. 자동 세포 카운터를 사용하여 명시야 현미경으로 하등액의 세포를 계수하고 시작 세포 수에서 이 값을 빼서 버블 세포 층에서 포획된 세포 수를 결정합니다.
  3. 이 단계 전에 비오티닐화된 항-CD28 항체를 최소 2시간 동안 상용 SAMB와 혼합하여 접합된 항-CD28 SAMB를 생성합니다. 접합에 필요한 항-CD28 항체의 양을 결정하려면 SAMB 제조업체에 문의하십시오. 항-CD28 접합 SAMB를 1.5(항-CD28 SAMB):1(세포)의 비율을 사용하여 단계 2.1로부터 생성된 버블-세포 현탁액에 첨가한다.
  4. EOE 회전을 사용하여 15분 동안 혼합한 다음, 단계 2.2에서 얻은 세포 수에 따라 완전한 T 세포 배지 또는 다른 원하는 배지와 mL당 총 부피를 200만 세포로 조정합니다.

3. 세포 배양 배지에서 공동자극된 세포의 확장

  1. 2.4단계에서 활성화된 세포 1mL를 웰당 2M/mL의 농도로 24웰 플레이트에 분배합니다. 37°C에서 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 배양한다.
  2. 24시간 후, 50 U/mL의 IL-2 및 25 ng/M의 가용성 항-CD3(OKT3)를 추가하여 0일째에 플레이팅된 초기 세포 수를 사용하여 계산된 바와 같이 확장을 더욱 장려합니다. 세포 플레이트를 가습된CO2 인큐베이터에 다시 넣고 37°C에서 밤새 배양하도록 합니다.

4. 선택 사항: 렌티바이러스로 활성화된 T 세포의 형질도입

참고 : 여기에 사용 된 접근법은 Prommersberger et al. 10.

  1. 렌티바이러스를 실온에서 해동하고 피펫팅으로 간단히 혼합합니다.
  2. 각 웰에서 중간 산액 600μL를 부드럽게 제거하고, 현재 웰 바닥에 있는 딸 세포나 용액 표면에 남아 있는 기포 층을 건드리지 않습니다.
  3. 웰당 5μg/mL 헥사디메트린 브로마이드를 추가하여 바이러스 형질도입을 향상시킵니다. 렌티바이러스 입자를 감염 다중성(MOI)이 3(세포당 렌티바이러스 입자)으로 추가합니다.
  4. 느린 가속과 감속을 위한 휴식 없이 플레이트를 800 x g 및 32°C에서 45분 동안 원심분리합니다. 세포를 37°C에서 가습된CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
  5. 4시간 후, 600μL의 시판되는 새로운 완전한 T 세포 배지와 50U/mL의 IL-2를 각 웰에 첨가하고, T 세포 확장을 위해 37°C에서 가습된CO2 인큐베이터에 세포 플레이트를 다시 놓습니다.

5. T 세포의 확장 (사전 형질 도입 유무에 관계없이)

  1. 2일마다 중간 산액에서 배지의 절반을 제거하고 새롭고 완전한 T 세포 배지로 교체하고 50U/mL 농도의 IL-2를 추가합니다.
  2. 세포 밀도를 평가하기 위해 일주일에 두 번 T 세포를 계수합니다. 세포 밀도가 2 x 10 6-2.5 x 106 cells/mL를 초과하면 세포를 더 큰 용기로 옮겨 5 x 105 cells/mL로 희석합니다.

6. T 세포 수확 및 유세포 분석

  1. 위아래로 피펫팅하여 각 웰의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 마이크로 버블을 포함하여 웰의 전체 내용물을 제거하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  2. 400μL의 무칼슘 및 마그네슘 무마그네슘 DPBS(-/-)로 각 웰을 세척하고 용액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 400 x g 로 원심분리합니다.
  3. 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 50 μL의 분리 완충액에 재현탁시킨다.
  4. 활성화 및 고갈 항체/염색 칵테일로 염색하고 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음과 같이 염색 칵테일을 준비하십시오 - 활성화 칵테일 : AF700-CD3, PE / 눈부심 -CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; 고갈 칵테일 : AF700-CD3, PE / 눈부심 -CD4, PE / Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. 분리 완충액 1mL를 넣고 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 400 x g로 원심분리하여 과도한 항체를 씻어냅니다. 상청액을 완전히 흡인하십시오.
  6. 세포 펠렛을 1mL의 분리 완충액에 재현탁시키고, 유세포분석 분석을 위해 적절한 용기 (예를 들어, FACS 튜브, 96-웰 플레이트 등)로 옮긴다. 권장되는 유세포분석 게이팅 체계는 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

T 세포를 구입한 PBMC로부터 단리하고, 프로토콜에 기재된 바와 같이 활성화를 위해 도말하였다. 음성 대조군 샘플 (구입 한 PBMCs)은 활성화되지 않았습니다. 이들 대조군 샘플은 마이크로버블 활성화 과정이 비접촉 및 자극되지 않은 T 세포 대조군과 비교하여 실험 샘플에 미치는 영향을 입증하기 위해 포함되었으며, 관찰된 활성화 마커는 추가된 활성화 인자의 결과이며 T 세포 자체에 내재되지 않았음을 보장하였다. 그림 2의 실험 개요에 따라, 세포를 T 세포 배지에서 2 x 106 cells/mL로 시딩하고, 만지지 않은/무자극되거나 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 28.2) SAMB와 공동 자극되었다. 배양물에서 48 시간의 자극 후, 세포를 zsGreen을 암호화하는 렌티 바이러스 입자로 형질 도입 하였다. 형질도입 후 4일 및 6일째에, 세포를 AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25,...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

기술된 프로토콜은 PBMC 샘플로부터 T 세포의 단리 및 마이크로버블을 갖는 배양 배지 내의 부유 T 세포의 활성화를 허용한다. 이 방법은 고유 한 부력이 세포에 공동 자극 신호를 도입하고 배양 배지에 현탁되어있는 동안 활성화하여 확장 된 세포의 장기간 자극에 대한 노출을 줄이는 독특한 기회를 제공하는 기능화 된 마이크로 버블에 의존합니다. 이러한 과잉 자극은 T 세포 고갈 마커의 발현 증가 및 치료 효능 감소를 초래할 수 있다11. 기능화된 마이크로버블에 부력으로 부착된 자극된 T 세포는 확장을 위해 세포 배양 플레이트의 바닥으로 떨어지는 손대지 않은 딸 세포를 생성하여 부력 자극 인자로부터 멀리 떨어진 성장 기간을 허용합니다. 자극 인자 (예 : 자기 비드 기반 프로토콜 12)에 대한 분리 된 T 세포의 장기간 노출이 확장 및 치료 효능 6,7,11

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

모든 저자는 제출 당시 마이크로 버블 분리 제품을 제조 및 판매하는 Akadeum Life Sciences의 직원입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올Gibco21985-023CAS: 60-24-2
Biologix 멀티-웰 배양 플레이트 24-웰 플레이트VWR 76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) 항체Biolegend302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) 항체Biolegend317320
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Gibco14190-136
GlutaMAX 보충제Thermofisher35050061
Human Recombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
렌티바이러스 입자 rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCBioIVTHUMANHLPB-0002562
조직 배양을 위한 페니실린/스트렙토마이신 100XVWR97063-708CAS: 8025-06-7
폴리브레네 감염/형질주입 시약Millipore SigmaTR-1003-GCAS:28728-55-4
풀링 인간 AB 혈청 플라즈마 파생 열 비활성화혁신적인 연구ISERABHI100mL
RPMI 1640 매체, GlutaMAX 보충제, HEPESGibco72400047
Streptavidin Microbubble Kit(Akadeum의 분리 완충액 포함)Akadeum11110-000

참고문헌

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

TCD3Anti CD28TCD69
부유 기반 T 세포 분리, 활성화 및 마이크로버블을 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 샘플로부터의 확장
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.