Method Article

부유 기반 T 세포 분리, 활성화 및 마이크로버블을 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 샘플로부터의 확장

DOI:

10.3791/64573

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  , 
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구의 목적은 일차 인간 T 세포를 분리, 활성화 및 확장하기 위한 부유 기반 분리의 타당성을 입증하는 것입니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 T 세포를 분리하여 생체 외 배양을 확립하는 과정은 연구, 임상 테스트 및 세포 기반 치료에 매우 중요합니다. 이 연구에서, 생체외 PBMCs로부터 T 세포를 분리, 활성화 및 확장하기 위한 간단하고 신규한 프로토콜이 제시된다. 이 연구는 기능화 된 부력 활성화 세포 분류 (BACS) 기술을 활용하여 T 세포를 분리하고 활성화합니다. 간단히 말해서, 이 프로토콜은 백혈구 유래 PBMC에서 CD3+ 세포의 양성 선택을 포함하고, 24웰 플레이트에서 형질도입하기 전에 사전 접합된 항-CD28 결합 스트렙타비딘 마이크로버블(SAMB)을 사용한 48시간 공동 자극을 포함합니다. 기능화된 마이크로버블은 세포를 부력적으로 활성화할 수 있는 독특한 기회를 제공하여 최소한의 피로로 확장을 허용하는 증식성 표현형을 유도합니다. 이 기술은 공동 자극 마이크로 버블이 부력을 유지하고 배양 배지의 상단으로 돌아가기 때문에 피로를 줄여 팽창 세포가 공동 자극 인자와 접촉하는 시간을 줄입니다. 상기 결과는 단리되고 배양된 T 세포가 활성화 및 증식하기에 충분한 자극을 받지만 과도한 PD-1의 존재에 의해 입증된 바와 같이, 과잉활성화로 이어지는 과활성화로 이어지는 정도는 아님을 나타낸다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 전 세계적으로 500개 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 치료 임상 시험이 진행 중이며 4개의 CAR-T 세포 치료제품이 시판되고 있습니다1. 그러나, 이러한 잠재적 치유 요법 2,3,4,5의 효능, 확장성 및 장기적인 성공을 개선하기 위해 해결되어야 하는 수많은 CAR-T 세포 연구 및 제조 요구가 여전히 존재한다. 입양 CAR-T 세포 임상 연구 및 제조는 말초 혈액 샘플로부터 T 세포를 분리하고 분리된 세포의 후속 자극, 형질도입 및 확장으로 시작됩니다. T 세포 회수, 순도 및 활성화/고갈 신호와 같은 파라미터는 CAR-T 세포 연구 및 제조 3,4,6을 위한 세포 분리 및 자극 기술을 선택할 때 신중한 고려가 필요합니다. 중요하게도, 치료 효능을 향상시키기 위해서는 T 세포 고갈과 같은 현재 제조 공정으로부터 발생하는 생물학적 장애....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 양성 선택을 이용한 마이크로버블로 T 세포 분리

참고: 이 프로토콜은 SAMB를 사용하는 소규모 CD3+ 양성 선택 접근 방식을 자세히 설명합니다.

  1. 100만 세포당 항체 25ng(25ng/M) 농도의 비오틴화 항-CD3(OKT3) 항체와 함께 2.5mL의 분리 완충액에 3 x 10 8개의 상업적으로 입수한PBMC 를 배양합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
  2. 스트렙타비딘 마이크로버블(SAMB)을 제조업체에서 보고한 SAMB 농도에 따라 0.5(SAMB 수량):1(세포 수량)의 비율로 추가합니다.
  3. 상업용 EOE(엔드 오버 엔드) 회전 장치를 사용하여 20rpm에서 실온에서 10-15분 동안 혼합합니다. 실온에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  4. 원심분리 후, 양성으로 선택된 세포는 SAMB와 함께 현탁액의 맨 위에 놓일 것입니다. 선택되지 않은 나머지 세포는 튜브 바닥의 셀 펠릿에 있습니다. 9인치 유리 피펫을 사용하여 버블 셀 층 아래의 팁을 튜브 바닥에 삽입하고 전자 피펫으로 세포 펠릿과 부탄산액을 흡입하여 새 튜브로 옮깁니다.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T 세포를 구입한 PBMC로부터 단리하고, 프로토콜에 기재된 바와 같이 활성화를 위해 도말하였다. 음성 대조군 샘플 (구입 한 PBMCs)은 활성화되지 않았습니다. 이들 대조군 샘플은 마이크로버블 활성화 과정이 비접촉 및 자극되지 않은 T 세포 대조군과 비교하여 실험 샘플에 미치는 영향을 입증하기 위해 포함되었으며, 관찰된 활성화 마커는 추가된 활성화 인자의 결과이며 T 세포 자체에 내재되지 않았음을 보장하였다. 그림 2의 실험 개요에 따라, 세포를 T 세포 배지에서 2 x 106 cells/mL로 시딩하고, 만지지 않은/무자극되거나 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 28.2) SAMB와 공동 자극되었다. 배양물에서 48 시간의 자극 후, 세포를 zsGreen을 암호화하는 렌티 바이러스 입자로 형질 도입 하였다. 형질도입 후 4일 및 6일째에, 세포를 AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기술된 프로토콜은 PBMC 샘플로부터 T 세포의 단리 및 마이크로버블을 갖는 배양 배지 내의 부유 T 세포의 활성화를 허용한다. 이 방법은 고유 한 부력이 세포에 공동 자극 신호를 도입하고 배양 배지에 현탁되어있는 동안 활성화하여 확장 된 세포의 장기간 자극에 대한 노출을 줄이는 독특한 기회를 제공하는 기능화 된 마이크로 버블에 의존합니다. 이러한 과잉 자극은 T 세포 고갈 마커의 발현 증가 및 치료 효능 감소를 초래할 수 있다11. 기능화된 마이크로버블에 부력으로 부착된 자극된 T 세포는 확장을 위해 세포 배양 플레이트의 바닥으로 떨어지는 손대지 않은 딸 세포를 생성하여 부력 자극 인자로부터 멀리 떨어진 성장 기간을 허용합니다. 자극 인자 (예 : 자기 비드 기반 프로토콜 12)에 대한 분리 된 T 세포의 장기간 노출이 확장 및 치료 효능 6,7,11

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 제출 당시 마이크로 버블 분리 제품을 제조 및 판매하는 Akadeum Life Sciences의 직원입니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-메르캅토에탄올Gibco21985-023CAS: 60-24-2
Biologix 멀티-웰 배양 플레이트 24-웰 플레이트VWR 76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) 항체Biolegend302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) 항체Biolegend317320
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Gibco14190-136
GlutaMAX 보충제Thermofisher35050061
Human Recombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
렌티바이러스 입자 rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCBioIVTHUMANHLPB-0002562
조직 배양을 위한 페니실린/스트렙토마이신 100XVWR97063-708CAS: 8025-06-7
폴리브레네 감염/형질주입 시약Millipore SigmaTR-1003-GCAS:28728-55-4
풀링 인간 AB 혈청 플라즈마 파생 열 비활성화혁신적인 연구ISERABHI100mL
RPMI 1640 매체, GlutaMAX 보충제, HEPESGibco72400047
Streptavidin Microbubble Kit(Akadeum의 분리 완충액 포함)Akadeum11110-000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

T Cell IsolationMicrobubble ActivationPeripheral Blood MononuclearT Cell ExpansionBuoyancy Activated Cell SortingCD3 Positive SelectionAnti CD28 MicrobubblesFlow CytometryT Cell ExhaustionActivation Marker CD69

Related Articles