2차 림프부종 유도를 위한 토끼 뒷다리의 슬와골 혈관 림프절 절제술

요약

여기에서는 토끼 뒷다리에서 안정적인 후천성 림프부종의 외과적 유도를 설명합니다. 이 실험 동물은 미세 수술 기술에 의한 림프 부종 치료의 효과를 추가로 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

림프부종은 종종 암과 그 치료와 관련된 흔한 상태로, 림프계의 손상을 초래하며, 현재의 치료법은 대부분 완치보다는 완화 요법에 그치고 있습니다. 종양 환자들 사이에서 이 질환의 발병률이 높다는 것은 정상적인 림프 기능과 병리학적 기능 장애를 모두 연구할 필요가 있음을 시사한다. 만성 림프부종을 재현하기 위해서는 적절한 실험 동물을 선택해야 합니다. 동물 모델을 확립하려는 시도는 림프계의 재생 능력에 의해 제한됩니다. 잠재적인 후보 중 토끼 뒷다리는 다루기 쉽고 인간 임상 시나리오에 외삽하기 쉬워 유리합니다. 또한, 이 종의 크기는 혈관 형성된 림프절 절제술을 위한 림프관을 더 잘 선택할 수 있습니다.

본 연구에서는 2차 림프부종을 유발하기 위한 토끼 뒷다리의 혈관 림프절 절제술을 제시한다. 마취된 동물은 단일 슬와골 절과 림프 채널을 식별할 수 있는 기술인 실시간 근적외선 형광을 사용하여 둘레 측정, 특허받은 청색 V 침투 및 인도시아닌 녹색 림프조영술(ICG-L)을 받았습니다. 확인된 구조에 대한 접근은 슬개골 결절을 절제하고 내측 및 외측 구심성 림프관을 결찰함으로써 이루어집니다. 슬와결절로 들어가지 않고 허벅지 내 대퇴 림프계에 합류하는 모든 림프관을 식별하고 결찰할 수 있도록 특별한 주의를 기울여야 합니다.

수술 후 평가는 유도 후 3, 6, 12개월에 뒷다리와 ICG-L의 둘레 측정을 사용하여 수행했습니다. 추적 관찰 과정에서 입증된 바와 같이, 동물은 12^개월까지 유지되는 피부 역류를 발달시켰으며, 이 실험 동물은 림프 부종 관리의 새로운 장기 평가에 유용했습니다. 결론적으로, 여기에 설명된 접근 방식은 실현 가능하고 재현 가능합니다. 또한, 제시된 기간 동안 인간 림프부종을 대표할 수 있으므로 유용한 연구 도구를 제공할 수 있습니다.

서론

림프부종은 전 세계적으로 발병하고 있고, 완치적이고 표준화된 치료법이 부족하며, 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미치기 때문에 특별한 주의가 필요한 만성 질환이다 ^1,2.

선진국에서는 림프부종이 주로 후천적으로 발생하며 유방암의 유병률이 높기 때문에 유방암에 이차적으로 발생합니다. 수술 후 10년이 지난 후 유방암 관련 림프부종의 누적 발생률은 최대 41.1%에 달할 수 있습니다³. 그러나 흑색종, 부인암, 비뇨생식기 종양, 두경부 신생물과 같은 질병도 이 질병의 높은 발병률과 관련이 있다⁴. 생존율을 높이기 위해 필요한 종양학적 치료의 일환으로 국소 림프절 절제술은 기능적 림프 배액의 중단으로 이어집니다. 어떤 경우에는 이로 인해 림프부종의 발병을 예방하거나 지연시키는 보상 기전이 발생하기도 한다⁵. 그러나 화학요법과 방사선요법을 시행할 때 이러한 메커니즘은 변화를 보상할 수 없으며 결과적으로 림프 부종이 발생합니다. 이는 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미치며, 환자의 기능적, 사회적, 심리적 안녕에 영향을 미친다 ^6,7.

림프부종에 대한 효과적인 치료법이 필요하기 위해서는 림프계의 생리병리학에 대한 이해가 필요하고, 정상 림프계와 기능 장애 림프계에서 복잡한 세포 메커니즘과 그 반응에 대한 깊은 통찰력이 필요합니다 ^8,9,10. 이러한 통찰은 초기에 만성 인간 질병을 재현할 수 있는 실험 동물 모델로부터 얻을 수 있다¹¹.

실험 동물 모델에서 림프 부종을 복제하려는 많은 시도가 있었습니다. 그러나 그들 대부분은 안정적인 동물 모델에서 만성 림프 기능 부전을 재현할 수 없다는 점, 연구 비용, 그리고 가장 중요하게는 순환을 회복할 수 있는 림프계의 뛰어난 재생 능력을 포함한 몇 가지 한계에 의해 방해를 받았습니다^12,13.

본 연구는 토끼 뒷다리를 이용하여 안정적인 후천성 림프부종을 수술로 유도하는 실험적 접근법을 제시한다. 문헌 검토에 따르면, 이 동물은 뒷다리를 배출하고 다리의 주요 대퇴 림프계에 도달하는 단일 슬와골 결절을 포함하는 뒷다리 림프계의 일관된 해부학적 구조로 인해 림프부종 발병에 최적인 것으로 간주될 수 있습니다^14,15.

토끼 뒷다리의 특정 해부학적 구조는 2차 림프부종을 유발하기 위해 인간에게 수행된 수술 절차를 재현할 수 있습니다. 따라서 이 절차는 미세수술 교육 및 전임상 연구에 사용되어 결과를 인간 의학에 외삽할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Center의 윤리 위원회와 유럽 법률을 기반으로 하는 지역 정부의 복지 지침에 의해 승인되었습니다.

1. 수술 전 및 수술 준비

1. 체중이 4-4.5kg이고 생후 4개월인 9마리의 뉴질랜드 흰 토끼 암컷을 22-25°C의 온도를 유지하는 별도의 우리에 수용하며 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다. 케이지에 표면적이 3m² 이고 높이가 40cm인 폴리설폰 트레이와 나무 부스러기가 있는 침대가 있는지 확인하십시오.
   1. 프로젝트 코드와 동물 식별 번호로 케이지를 식별합니다.
   2. 스트레스로 인한 문제를 예방하기 위해 수술 전 1주일 동안 동물을 적응시킵니다. 마취 전에 각 동물의 건강 상태가 양호한지 확인하기 위해 혈액 샘플의 수술 전 실험실 값을 수집합니다.
2. 모든 토끼가 각 수술 절차 전에 12시간 금식을 따르도록 합니다.
   1. 투약 전 후 안면 마스크(홀 마스크)를 사용하여 100% 산소와 3-5L/min의 신선한 가스 흐름으로 5분 동안 토끼에게 사전 산소를 공급합니다. 미다졸람(0.3mg/kg) 및 프로포폴(10mg/kg)을 정맥 주사하여 동시 유도 단계를 수행합니다.
3. 3.0-3.5개의 기관내관으로 토끼를 삽관하고, 폐렴 형성과 함께 인공호흡기에 연결된 반폐쇄 원형 회로에 연결하여 처음 5분 동안 1L/min의 신선한 가스를 흘리고 이후 0.5L/min으로 설정합니다.
   1. 기화기에 설정된 3%-3.5% 농도의 세보플루란을 흡입하여 유지 마취를 수행합니다.
4. 수술 과정 내내 귀의 가장자리 정맥을 통해 Ringer의 젖산 용액(2-4mL/kg/h)을 마취된 토끼에게 지속적으로 주입합니다.
   1. 안구 표면을 보호하기 위해 눈 보호 연고를 사용하십시오.
5. 전신 마취 모니터링: 직장 온도계를 사용하여 38.7-39.7 °C에서 온도를 모니터링하고, 점막 색을 검사하고, 토끼 맥박 산소 측정기를 사용하여 >95%에서 O₂포화도 및 180-240bpm에서 심박수를 모니터링합니다.
6. 동물이 절차 내내 일정한 온도를 유지하도록 열 지지대를 놓습니다.
7. 수술 중 진통제를 위해 케토롤락(1.5mg/kg)과 트라마돌(3mg/kg)을 정맥 주사합니다.
8. 수술 전과 수술 후 5일째에 항생제(7.5mg/(kg∙day) 엔로플록사신을 피하[s.c.])를 투여하고, 5일간 수술 후 진통제(10μg/(kg∙day) 부프레노르핀 s.c.)를 투여한다.
9. 토끼를 누운 자세로 놓고 동물의 뒷다리와 서혜부 부위를 면도합니다. 동물을 등쪽/누운 자세로 눕히고 뒷다리와 서혜부 부위의 털을 자릅니다.
10. 이전에 면도한 피부에 0.5% 클로르헥시딘과 70% 에탄올을 도포하여 피부 방부를 수행합니다. 해당 부위가 소독되면 왼쪽 뒷다리를 제외한 멸균 천으로 토끼를 덮습니다.

2. 슬와골 혈관 림프절 절제술(그림 1)

1. 0.2-0.3mL의 인도시아닌 그린(ICG)을 왼쪽 뒷다리의 두 번째 및 세 번째 디지털 간 공간에 피내 침투합니다. 몇 분 동안 마사지하고, 부드럽게 구부리고, 뒷다리를 펴서 염료가 림프관으로 흡수되는 것을 용이하게 합니다. 반대쪽 팔다리를 대조군으로 사용합니다.
2. 실시간 근적외선 형광 카메라를 사용하여 무릎 높이에서 교차하는 림프관과 피부의 슬와골 림프절(PLN)을 시각화하고 표시(수술 마커 사용)합니다(그림 2).
3. 특허받은 청색 V(0.2mL)를 디지털 간 영역에 주입하여 림프관과 림프절을 나중에 식별합니다.
4. 실시간 근적외선 형광 카메라(그림 3)를 사용하여 PLN을 식별하면 피부를 통해 볼 수 있는 좌골 정맥을 통해 뒷다리의 긴 축에 세로로 슬와구 중앙에 2cm의 절개를 만듭니다.
   1. 실시간 근적외선 형광 카메라로 림프계의 실시간 파노라마 이미지를 얻으려면 클래스 1 레이저가 장착된 광학 헤드를 여기 광원으로 사용하고 동물의 발목에서 뒷다리의 무릎까지 근적외선 감응 카메라를 사용하십시오.
   2. 근육 근막 위의 림프관을 피하 지방을 절제하여 시각화⁵. 림프관은 2.3단계에서 특허받은 파란색 V 염색으로 인해 파란색으로 나타납니다.
   3. 미세수술 겸자를 사용하여 절개 부위를 늘리고 혈관 및 구심성 림프 척추경을 포함한 PLN을 노출시킵니다. 모든 림프 및 혈관 구조에 대한 명확한 가시성을 보장합니다(그림 4).
   4. 협측 정맥 아래와 대퇴 이두근 및 내측 햄스트링 근육 사이에 있는 직경 0.8mm의 PLN을 확인합니다.
5. PLN의 내측 측면에 있는 두 개의 주요 림프관을 확인합니다. 이 혈관은 원위 복재 정맥과 평행하게 위치하며 PLN에 접근함에 따라 미세 혈관 네트워크로 나뉩니다(그림 5).
6. 림프절 척추경을 절개하면서 주변 조직과 혈관의 손상을 방지합니다(그림 6).
7. 내측 동맥(슬와동맥의 한 분지)과 외측 복재정맥을 10/0 나일론 비흡수성 봉합사를 사용하여 원위 및 근방으로 결찰합니다.
8. 허벅지 내의 대퇴 림프계에 직접 합류하지만 PLN으로 들어가지 않는 두 그룹의 구심성 림프관을 식별하고 소작합니다(그림 7).
   참고: 첫 번째 그룹은 다리 위쪽과 종아리에서 림프액을 배출하는 내측 구심성 림프관에 해당합니다. 두 번째 그룹은 하지 근육 조직에 있는 림프관으로 구성됩니다. 이 혈관은 복재정맥과 함께 비복근을 따라 움직입니다.
9. 실시간 근적외선 형광 이미징을 반복하여 림프계의 완전한 중단을 확인합니다.
10. 림프관 형성 가능성을 피하기 위해 주변 지방 조직을 완전히 제거하십시오.
11. 수술 후 자해(auto-tillation)를 피하기 위해 연속 피내 패턴을 사용하여 4-0 폴리글리콜산(PGA) 흡수성 꼰 봉합사(16mm 3/8 삼각형 바늘 사용)로 절개 부위를 봉합합니다.
12. 수술 후 토끼를 우리에 개별적으로 수용합니다. 감시를 받고 16°C에서 22°C 사이의 실온에 보관하십시오.

3. 수술 후 평가

1. 유도 후 3개월, 6개월, 12개월에 수술 후 평가를 수행합니다.
2. 이전에 사용한 단계에 따라 토끼를 마취합니다(단계 1.2-1.7).
3. 마취 된 토끼의 뒷다리 둘레를 줄자로 측정하십시오. 2cm마다 측정하며 첫 번째 점은 발목이고 마지막 점은 무릎입니다. truncated cone 공식을 사용하여 총 부피를 계산합니다.
4. 림프 기능을 평가하기 위해 인도시아닌 녹색 림프조영술(ICG-L)을 사용합니다.
   1. 0.2-0.3mL의 ICG를 피내 2차 및 3차 지간공간에 침투시키고 1분 동안 부드럽게 마사지하여 림프관으로의 ICG 흡수를 촉진합니다.
5. 15분 후 근적외선 형광 시스템을 사용하여 이미지를 수집하여 피부 역류를 평가합니다.
6. 후속 조치가 완료되면 중재에 사용된 것과 동일한 마취 프로토콜에 따라 토끼를 안락사시킵니다. 원하는 마취 평면에 도달하면 평균 2meq/kg의 속도로 염화칼륨을 이도 정맥에 정맥 주사합니다.

결과

본 연구에서는 9마리의 토끼가 림프부종 유도 검사를 받았으나 수술 직후 3마리의 토끼가 사망하여 평가를 할 수 없었다. 연구 데이터는 수술 후 3개월, 6개월, 12개월에 3명의 독립적인 연구자에 의해 수집되었습니다. 림프계 기능과 피부 역류를 평가하기 위해 전신 마취 하에 둘레 뒷다리 측정 및 ICG-L을 수행했습니다.

수술 후 3개월에 ICG-L이 얻은 데이터는 토끼의 왼쪽 뒷다리에 피부 역류와 PLN이 없는 것을 보여주었으며, 이는 정상적인 림프계 기능의 중단과 양립할 수 있습니다. 수술 후 6개월 및 12개월의 ICG-L 결과에서 외과적 탐색 중 좌파와(popliteal fossa) 원위부의 피부 역류와 확장된 림프관이 나타났습니다(그림 8).

임상적 림프부종의 증거는 검사 또는 주위 뒷다리 측정에서 발견되지 않았다. 왼쪽 뒷다리의 부피 증가는 오른쪽 뒷다리(대조군)의 ...

토론

실험 동물에서 PLN을 절제하는 것은 평가 및 연구를 위해 사지에 2차 림프부종을 유발할 수 있는 비교적 새로운 절차입니다. 림프절 절제술 후에는 림프계 기능의 변화, 림프 축적 및 확장된 것처럼 보이는 림프관의 조직학적 변화가 있는 기간이 있습니다. 이 림프 축적이 적절한 수준에 도달하면, 인간에서 관찰되는 것과 유사한 림프 부종의 특징적인 피부 역류를 ICG-L과 같은 객관적인 기술을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 비용 효율적인 전임상 연구 동물을 만들 수 있으며, 이는 이러한 병태생리학적 과정을 예방하고 치료하는 데 도움이 될 수 있습니다.

수술 중에, 특허 청색 V 출원은 뒷다리의 림프관을 통한 흐름의 유무를 확인할 수 있다⁵. 이 기술의 단점은 림프관을 수술 중에만 관찰할 수 있다는 것입니다. 따라서 실시간 근적외선 형광 카메라 기술을 사용하고 있으며...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bleu Patente V sodique (Guerbet)	Guerbet. Villepinte, France		2.5g/100mL
부프레노르핀(Bupaq)	Richter Pharma. Wels, Austria	0820645AA	3 mg/10 mL
플루오빔	플루옵틱스. 프랑스 그르노블	형광 이미징
(노몬)	Normon, S.A. 스페인 마드리드	T01H	30 mg/mL
Microsoft Excel	Microsoft	버전 16.66.1
Midazolam (Normon)	Normon, S.A. 마드리드, 스페인	T35M	15 mg/3 mL
Pentero 800 현미경, 형광 모듈	Carl Zeiss Meditec AG. 괴슈비처 슈트라세 51-52. 예나, 독일	302581-9245-000
염화칼륨 (브라운)	B.Braun. 스페인 바르셀로나	19262010	20mmol/10mL
프로포폴(프로포미터, Orion Pharma)	오리온 파마. Spoo, 핀란드	20R039B	200 mg/20 mL
RÜ SCH 기관내관	Teleflex Medical, IDA, 비즈니스 및 기술 공원. 아티오네, 아일랜드.	12CE 12	크기 튜브 4.0 ID mm
Sevoflurano (SevoFlo, Zoetis)	Zoetis 벨기에. Luvain-la-Neuve, 벨기에	6093559	1000 mg/g (250 mL)
트라마돌 (노르몬)	Normon, S.A. 마드리드, 스페인	T08U	100 mg/2 mL