본 프로토콜은 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 지카 바이러스(ZIKV)의 증식과 24웰 및 96웰(고처리량) 형식의 세포 기반 비색 면역검출 방법을 사용한 ZIKV의 정량화에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
지카 바이러스(ZIKV)는 플라비바이러스(Flavivirus) 속에 속하는 모기 매개 바이러스입니다. ZIKV 감염은 선천성 뇌 이상 및 성인의 길랭-바레 증후군과 관련이 있습니다. 질병 기전을 이해하기 위한 ZIKV에 대한 연구는 백신 및 치료제 개발을 촉진하는 데 중요합니다. 바이러스를 정량화하는 방법은 바이러스학 분야에서 중요하고 기본적입니다. 초점 형성 분석(FFA)은 항체로 바이러스 항원을 검출하고 과산화효소 면역염색 기술을 사용하여 세포의 감염 병소를 식별하는 바이러스 정량 분석법입니다. 현재 연구에서는 24-well 및 96-well(고처리량) 형식을 모두 사용하는 바이러스 전파 및 정량화 프로토콜을 설명합니다. 다른 유사한 연구와 비교했을 때, 이 프로토콜은 다른 바이러스에 대한 이 분석법의 사용을 확장하기 위한 가이드 역할을 할 수 있는 초점 크기 최적화를 추가로 설명했습니다. 첫째, ZIKV 증식은 Vero 세포에서 3일 동안 수행됩니다. ZIKV를 함유하는 배양 상층액은 FFA를 사용하여 수거하고 정량화합니다. 간단히 말해서, 바이러스 배양을 Vero 세포에 접종하고 2-3일 동안 배양합니다. 그런 다음 병소 형성은 세포 고정, 투과화, 차단, 항체 결합 및 과산화효소 기질을 사용한 배양을 포함한 최적화된 염색 공정 후에 결정됩니다. 염색된 바이러스 병소는 실체 현미경(24-웰 형식의 수동 계수) 또는 소프트웨어 분석기(96-웰 형식의 자동 계수)를 사용하여 시각화됩니다. FFA는 재현 가능하고 비교적 빠른 결과(3-4일)를 제공하며 플라크를 형성하지 않는 바이러스를 포함한 다양한 바이러스에 사용하기에 적합합니다. 결과적으로 이 프로토콜은 ZIKV 감염 연구에 유용하며 다른 임상적으로 중요한 바이러스를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
지카 바이러스(ZIKV) 감염은 모기 매개 바이러스성 질병으로 부상하고 있습니다. ZIKV의 첫 번째 고립은 1947년 우간다에서 이루어졌다 1,2; 1947년부터 2007년까지는 임상 증상이 가장 흔하게 무증상이고 자기 제한적인 열성 질환을 특징으로 하기 때문에 방치되었습니다. 2007년 지카 바이러스는 얍 제도에서 시작되었고3,4 2013년부터 2014년까지 태평양 지역(프랑스령 폴리네시아, 이스터 섬, 쿡 제도, 뉴칼레도니아)에서 더 큰 전염병이 발생했다 5,6,7,8 성인에서 처음으로 심각한 신경학적 합병증인 길랭-바레 증후군(GBS)이 보고되었다 9. 2015년과 2016년 사이에, 2013년 브라질에서 ZIKV의 아시아 유전자형이 출현한 후 처음으로 광범위한 ZIKV 전염병이 아메리카 대륙을 휩쓸었다
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프로토콜
1. 바이러스 전파
- 세포 준비
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 2mM L-글루타민이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 12mL가 포함된 75cm2 세포 배양 플라스크에서 Vero 세포를 성장시킵니다( 재료 표 참조). 5 % CO2 로 37 ° C의 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
- 현미경으로 세포를 모니터링하십시오. 세포가 70%-90% 밀도에 도달하면 사용할 준비가 된 것입니다(그림 1A).
알림: Vero 셀은 약 24시간17분마다 두 배가 됩니다. 1:10의 희석은 75cm2 플라스크에서 80%-90% 밀도에 도달하는 데 3-4일이 소요되어야 합니다. 매일 또는 격일로 세포를 모니터링합니다.
- 세포 단층의 감염
- 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 성장 배지를 제거합니다. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS) 3mL로 플라스크를 2회 헹굽니다.
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결과
ZIKV는 그림 3에 개략적으로 요약된 것처럼 FFA를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 24웰 플레이트의 경우, 감염된 Vero 세포는 감염 후 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 및 96시간에 고정되었습니다. 그 결과, 감염 후 96시간(4일) 후에도 세포가 온전한 상태로 유지됨(세포 분리가 관찰되지 않음)하는 것으로 나타났습니다(그림 4 및 보충 그림 8A-E). 바이러스 병소의 출현은 감염 후 48시간(2일)에 처음 관찰되었습니다(그림 4A-F). 그러나 초점 크기가 너무 작아 초점의 정확한 계산이 어려웠습니다. 최적의 병소 크기는 감염 후 60시간(2.5일)에 달성되었습니다(그림 4B). 후자의 시점(감염 후 72시간, 84시간, 96시간)에는 .......
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토론
바이러스 역가를 결정하기 위한 몇 가지 분석법이 있습니다. PFA는 FFA와 유사한 바이러스 정량 프로토콜을 가지고 있으며, 바이러스 접종물을 희석하여 개별 플라크 또는 병소를 구별할 수 있습니다. 염색 후, 각 플라크 또는 병소는 접종물(19) 내의 단일 감염 입자를 나타낸다. PFA는 세포 용해 또는 사멸로 인한 플라크 형성을 시각화하기 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색됩니다. 따라서 PFA는 바이러스가 CPE를 유발하는 데 더 오랜 시간이 필요하고 세포 용해 또는 사멸을 유도하는 바이러스에만 국한되기 때문에 시간이 더 많이 걸립니다. 많은 실험실에서 FFA를 사용하여 ZIKV 19,20,21,22,23,24,25를 포함한 플라비바이러스에 대한 전염성 바이러스 역가를 성공적으로 측정했습니다.
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공개 사항
저자는 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
이 연구는 장기 연구 보조금 제도(LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018)와 고등 기관 우수 센터(HICoE) 프로그램(MO002-2019)에 대한 자금 지원에 따라 말레이시아 고등 교육부의 지원을 받았습니다. 초점 형성 분석을 위한 염색 워크플로우를 보여주는 이 연구의 그림 3은 BioRender.com(2022)의 "DAB Immunohistochemistry"에서 채택한 것입니다. https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry 에서 가져옴.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 & 마이크로; m 폴리에테르설폰 주사기 필터 | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Nest | 615601 | |
| 10 mL 멸균 혈청학 피펫 | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL 스크류 캡 튜브 | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24웰 플레이트 | Corning | 3526 | |
| 25 mL 멸균 혈청학 피펫 | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 ° 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL 멸균 혈청학 피펫 | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL 원심분리 튜브 | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 조직 배양 플라스크 | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered Saline (PBS) | N/A | N/A | 8 mM Na2HPO4 4.0 g, 1.5 mM KH2PO4 4.0 g, 0.14 M NaCl 160 g, 2.7 mM KCl 4.0 g, MilliQ H2O |
| 생물 안전 캐비닛 1 L, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 범용 ELISpot/FluoroSpot 분석기 | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | 상용 소프트웨어 분석기 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine 혈청 (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| 염소 항-마우스 IgG 보조 항체와 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| 헤마사이토미터 | Laboroptik LTD | Neubauer 개선된 | |
| IGEPAL CA-630 세제 | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| 도립 현미경 | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 저점도 카르복시메틸 셀룰로오스 (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| 다채널 마이크로피펫 (10 - 100 µ L) | Eppendorf | 3125000036 | |
| 멀티채널 마이크로피펫 (30 - 300 &마이크로; L) | Eppendorf | 3125000052 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| 싱글 채널 피펫 (10 - 100 µ L) | Eppendorf | 3123000047 | |
| 싱글 채널 피펫 (100 - 1000 µ L) | Eppendorf | 3123000063 | |
| 싱글 채널 피펫 (20 - 200 µ L) | Eppendorf | 3123000055 | |
| 탈지유 | Sunlac Low Fat | N/A | 염색 단계 차단을 위해 1x PBS에 3% 탈지유를 준비합니다 |
| 차아염소산나트륨 | Clorox | N/A | 플라스크/플레이트에서 버려진 감염성 액체 폐기물을 소독하기 위해 |
| 실체현미경 | Nikon | SMZ1000 | |
| 일회용, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | ||
| SS10L21G Vero 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 | - | ECACC 88020401 | 협업자로부터 받았습니다. 그러나 다른 공급업체에서 얻은 Vero 셀은 일부 최적화와 함께 사용할 수 있어야 합니다. |
참고문헌
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J.
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재인쇄 및 허가
