방법 논문

통계적 기법을 사용한 E. coli Rosetta pLysS 세포의 재조합 키틴 탈아세틸화효소 발현의 공정 평가 및 동역학

DOI:

10.3791/64590

⸱

2023년 3월 10일

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

이 논문에서

요약

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현재 프로토콜에서는 E. coli Rosetta pLysS 세포에서 재조합 세균 키틴 탈아세틸화효소(BaCDA)의 발현을 위한 공정 조건을 최적화하기 위해 통계 기법인 CCD(Central Composite Design)가 적용되었습니다. CCD의 사용은 BaCDA의 발현 및 활성을 ~2.39배 증가시키는 결과를 가져왔습니다.

초록

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최근 몇 년 동안, 효소 키틴 탈아세틸화효소를 사용하여 키틴을 키토산으로 탈아세틸화하는 보다 친환경적인 경로가 중요해졌습니다. 모방 특성을 가진 효소로 전환된 키토산은 특히 생물 의학 분야에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. 다양한 환경 공급원에서 여러 재조합 키틴 탈아세틸화효소가 보고되었지만, 이러한 재조합 키틴 탈아세틸화효소의 생산을 위한 공정 최적화에 대한 연구는 없습니다. 본 연구는 E. coli Rosetta pLysS에서 재조합 박테리아 키틴 탈아세틸화효소(BaCDA) 생산을 극대화하기 위해 반응 표면의 중앙 복합 설계 방법론을 사용했습니다. 최적화된 공정 조건은 포도당 농도 0.061%, 유당 농도 1%, 배양 온도 22°C, 교반 속도 128rpm, 발효 30시간이었습니다. 최적화된 조건에서, 유당 유도로 인한 발현은 발효 16시간 후에 시작되었다. 최대 발현, 바이오매스 및 BaCDA 활성은 유도 후 14시간 후에 기록되었습니다. 최적화된 조건에서, 발현된 BaCDA의 BaCDA 활성은 ~2.39배 증가하였다. 공정 최적화를 통해 총 발효 주기가 22시간 단축되고 주입 후 발현 시간이 10시간 단축되었습니다. 이 연구는 중앙 복합재 설계와 동역학 프로파일링을 사용하여 재조합 키틴 탈아세틸화효소 발현의 공정 최적화를 보고한 최초의 연구입니다. 이러한 최적의 성장 조건을 조정하면 덜 탐사된 모네란 탈아세틸화효소의 비용 효율적인 대규모 생산으로 이어질 수 있으며, 생체 의학 등급의 키토산 생산을 위한 보다 친환경적인 경로를 시작할 수 있습니다.

서론

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키틴질은 구조적 β, 1-4 글리코시드 결합 천연 고분자로, 셀룰로오스 다음으로 자연에서 두 번째로 풍부한 다당류입니다. 이러한 사실에도 불구하고, 키틴은 불용성1로 인해 산업 응용이 제한적입니다. 이 병목 현상은 키틴에 N-탈아세틸화를 가함으로써 해결되며, 이는 양전하를 부여하고 생성된 고분자인 키토산1의 용해도를 증가시킵니다. 키틴은 화학과 효소의 두 가지 경로를 통해 키토산으로 변형될 수 있습니다. 키토산의 생물 의학 적용에는 제어되고 정의된 탈아세틸화가 필요하며, 이는 화학 경로 2,3에서 제한됩니다. 이러한 한계는 탈아세틸화 과정에 대한 녹색 효소 접근법인 키틴 탈아세틸화효소(CDA)를 사용하여 해결할 수 있습니다 4,5.

키틴 탈아세틸화효소는 탄수화물-활성 효소(CAZY) 데이터베이스에 정의된 탄수화물 에스테라제 4(CE-4) 계열에 속합니다. CE-4 계열의 효소는 보존 영역으로서 NodB 상동성 또는 다당류 탈아세틸화효소 도메인을 공유합니다. 통계 도구인 CCD(Central Composite Design)는 여러 야생형 키틴 변형 효소 6,7,8,9의 최적화에 사용됩니다. 그러나 야생형 유기체의 사용에서 다운스트림 단계는 지루해지므로 재조합 효소 10,11,12,13,14,15,16,17로 전환됩니다. 최근 몇 년 동안 해양 공급원의 할로필릭 재조합 CDA는 생물 의학 등급 키토산의 산업 적용 및 생산이 용이하기 때문에 중요성이 높아졌습니다18,19.

E. coli에서의 재조합 효소 생산은 그 과정에 제한이 있으며, 사용된 유전자와 플라스미드에 따라 E. coli에서의 발현이 다르기 때문에 배지 최적화가 필요하다20. 따라서 적절한 공정 및 영양 매개변수를 선별하는 것이 중요합니다. 일반적으로 사용되는 최적화 방법인 OFAT(One Factor at a Time)는 단계별 실험을 수행하는 데 엄청난 자원과 시간이 필요합니다. 이 방법은 매개변수 20,21,22,23 간의 상호 작용에 관한 통계 정보가 부족합니다. 따라서 E. coli Rosetta pLysS에서 Halophilicbacterial chitin deacetylase(Ba CDA) 발현 수율 및 BaCDA 활성을 연구하기 위해 반응 표면 방법론(RSM)의 CCD를 채택했습니다. E. coli 숙주에서 발현 최적화를 위해 고려된 매개변수는 유당 농도, 포도당 농도, 배양 온도, 교반 속도 및 배양 시간이었습니다. 대부분의 대장균 발현 연구에서 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)가 함유된 Luria Bertani(LB) 배지가 유도제로 사용되었습니다. 이러한 IPTG의 추가는 정기적인 성장 모니터링이 필요했다24. 발효 과정에서 이러한 반복적인 매개는 또한 오염의 길을 열어줍니다. 따라서 연구 그룹은 유당을 유도제로 하는 훌륭한 국물(TB)로 전환했습니다. IPTG 대신 유당을 미디어에 포함하면 이러한 우려가 해결됩니다. 대장균은 이 유당을 섭취하고 부산물로 동종유당을 생성하여 자동 유도 상태를 초래합니다. 이 자동 유도 매체에는 글리세롤이 포함되어 있으며, 이는 재조합 단백질의 수율이 개선되었습니다25.  TB 배지에서 이러한 재조합 단백질의 과발현은 공정 매개변수를 최적화함으로써 더욱 개선되었습니다. 본 연구에서는 E. coli Rosetta pLysS 세포에서 호염성 BaCDA의 이종 발현을 최적화하기 위해 중앙 복합 설계를 적용했습니다. 선택된 공정 매개변수는 배양 온도, 교반 속도 및 배양 시간이었고 평가된 영양 매개변수는 포도당 및 유당 농도였습니다. 할로필릭 BaCDA 발현은 예측된 최적화된 조건으로 평가되고 SDS-PAGE를 사용하여 교차 검증되었습니다.

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프로토콜

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1. 표현 매체와 문화 조건

  1. 15에 설명된 바와 같이 열충격법을 사용하여 BaCDA 유전자를 포함하는 pET-22b 벡터를 E. coli Rosetta pLysS 수용 세포로 변환합니다.
    알림: 미생물로 작업하는 동안에는 주의해야 합니다. 모든 미생물 작업은 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛 후드 내부에서 수행되어야 합니다.
  2. 16°C 및 180rpm에서 0.05%(w/v) 포도당과 0.2%(w/v) 유당을 함유하는 TB 배지에서 예비 발현 연구를 수행합니다. BaCDA 클로닝 플라스미드를 포함하는 100mL의 배지에서 6.792 x 107E. coli Rosetta pLysS 세포를 고정상에 도달할 때까지 성장시킵니다. 언급된 성장 조건에서 E. coli Rosetta pLysS 세포는 10.85 ± 0.21의 광학 밀도 600(OD600)에 도달합니다. 
    참고: TB 매체의 조성(% w/v): 트립톤, 1.2; 효모 추출물, 2.4; 글리세롤, 0.6; 및 1x TB 염 (17 mM KH2PO4 및 74 mM K2HPO4) 17.

2. 최적화 및 실험 설계

  1. 실험을 설계하고 통계 툴 소프트웨어를 사용하여 중앙 복합 설계에 2차 다항식 모델을 피팅합니다. 본 연구에서 사용된 통계 소프트웨어는 MINITAB 17.0(시험판)이었습니다.
    1. 이렇게 하려면 소프트웨어를 열고 Stat > DoE > Response surface > Create response surface > Response design > Central composite(반응 표면 생성) 버튼을 클릭합니다. 출력이 대화 상자로 나타납니다.
  2. 대화 상자에서 배양 온도, 교반 속도, 배양 시간, 포도당 농도 및 유당 농도의 5가지 매개변수를 5가지 수준(-2, -1, 0, +1, +2)으로 공급합니다.
    1. 이렇게 하려면 대화 상자에 레벨이 있는 매개변수를 입력하고 모든 매개변수의 세부 정보를 입력한 다음 확인을 누릅니다. 이렇게 하면 중심점에서 6번의 반복실험이 있는 실험 설계 매트릭스가 생성되며 32번의 실험 런이 필요합니다. 소프트웨어는 CCD를 사용하여 공정 최적화에 사용되는 코드화된 용어와 코딩되지 않은 용어로 파라미터와 그 수준을 포함하는 테이블을 생성합니다(표 1).
  3. 소프트웨어에서 생성된 조건으로 32개의 실험을 수행합니다. 실험 결과를 코드화된 단위와 코드화되지 않은 단위로 수준과 매개변수를 포함하는 실험 설계 매트릭스(소프트웨어에 의해 생성됨)에 공급합니다(표 2).
  4. 소프트웨어를 사용하여 실험 설계 매트릭스(표 2)를 분석합니다. 이렇게 하려면 소프트웨어를 열고 데이터시트에 응답을 공급합니다. 통계 > 실험 > 반응 표면 > 반응 열 > 반응 표면 설계 해석 > 확인을 선택합니다. 출력은 통계적 유의성을 위해 분석되고 모델은 소프트웨어에 의해 예측됩니다.

표 1: E. coli Rosetta pLysS 세포에서 재조합 키틴 탈아세틸화효소의 발현을 추정하기 위해 실험 설계에 사용된 코딩 및 비코딩 용어의 매개변수와 그 수준. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: E. coli Rosetta pLysS 세포에서 재조합 키틴 탈아세틸화효소의 실험 및 예측된 BaCDA 활성(발현)을 사용한 실험 설계 매트릭스. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

3. 모델의 검증

  1. 소프트웨어에서 사용할 수 있는 응답 최적화 도구를 사용하여 설계된 모델을 검증합니다.
  2. 소프트웨어가 예측한 최적 조건에서 발효를 반복하고 실험 값을 소프트웨어 예측 값과 비교합니다.
    1. 이렇게 하려면 소프트웨어를 열고 반응 열 > 통계 > DoE > 반응 표면 > 반응 최적화 프로그램 > 최대화 > 확인을 선택합니다. 출력은 소프트웨어가 예측한 최적의 공정 조건과 값입니다. 예측된 최적 조건에서 발효를 반복하고 값을 비교합니다.

4. 분석 방법

  1. 발현, 바이오매스 및 단백질 정량화
    1. 실험 설계 매트릭스에서 소프트웨어가 제공한 32가지 조건에서 발효를 수행합니다(표 2). 각 실행 후 4°C에서 10분 동안 5,405 x g 에서 배양물을 원심분리하여 펠릿을 얻습니다. 세포 펠릿의 무게를 측정하여 바이오매스 수율을 측정합니다.
      참고: 모든 미생물 취급은 무균 상태(즉, 생물 안전 캐비닛 내부)에서 수행해야 합니다.
    2. 세포 펠렛을 용해하여 초음파 처리에 의한 주위 단백질을 얻습니다. 각 세포 펠릿 그램에 5mL의 용해 완충액(50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10mM Imidazole)을 추가하고 60% 진폭에서 10초 켜짐 및 10초 꺼짐의 펄스로 10회 주기 동안 초음파 처리하여 중단합니다. 5,405 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 용해물을 수집합니다. Bradford의 분석법으로 단백질 농도를 정량화합니다26.
      참고 : 단백질 변성을 피하기 위해 초음파 처리는 추운 조건에서 수행해야합니다. 초음파 처리를 수행하는 동안 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
    3. SDS-PAGE를 사용한 후 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 BaCDA 발현을 분석합니다. 12% 비스-아크릴아미드 겔에 10μL의 용해성 세포 용해물(주위 단백질)을 로드하고 100V 전류에서 2시간 동안 1x 트리스-글리신-SDS(TGS) 완충액 하에서 실행합니다. 실행이 완료된 후 젤을 Coomassie blue로 염색하고 탈염하여 배경27을 제거합니다.
    4. 젤 문서화 장치를 사용하여 이미지를 캡처합니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 픽셀 값 형태의 밴드 강도를 비교하여 BaCDA 표현식을 결정합니다. 가장 낮은 BaCDA 활성과 바이오매스를 기준 픽셀 28로 사용한 실험 실행을 고려하십시오.
      1. 이렇게하려면 소프트웨어를 열고 이미지 파일을 연 다음 직사각형 상자를 사용하여 각 차선을 선택하십시오. 분석 으로 이동하여 각 레인을 100%로 설정한 다음 사각형 상자를 사용하여 각 레인에서 과도하게 표현된 밴드를 선택합니다. Analyze( 분석 )로 이동하여 밴드의 강도를 결정하고, 각 레인에서 프로세스를 반복하고, 결과를 .xls 파일로 내보냅니다. BaCDA 활성이 가장 낮은 실험 실행의 밴드 강도를 기준 강도로 간주하고 각 레인의 발현을 분석합니다.
  2. 효소 활성 분석
    1. 에틸렌 글리콜 키틴(1 mg/mL; EGC)를 기판으로 사용한다(29).
    2. 20 μL 의 BaCDA가 800 rpm에서 교반하여 30 ° C에서 1 시간 동안 40 μL의 50 μL Tris-HCl (pH 7) 버퍼가있는 상태에서 기판의 40 μL와 반응하도록합니다.
    3. 1시간 후, 4°C에서 15분 동안 2,111 x g 의 3kDa 컬럼을 통해 100μL 반응물을 원심분리합니다. BaCDA를 포함하는 잔류물을 버리고 반응 중에 방출된 아세테이트를 함유하는 여과액을 회수한다. 아세테이트 분석에 여과액을 사용하여 BaCDA 활성을 측정합니다.
      참고: 효소의 한 단위는 분당 효소 마이크로리터당 기질에서 1μM의 아세테이트를 방출하는 활성으로 정의됩니다. 효소 활성 분석은 삼중으로 수행되었으며 그에 따라 각각의 효소 활성을 계산했습니다.
  3. 유당 유도의 발효 동역학
    1. 활성 프로파일을 조사하여 유당 유도 지점과 발현 시작점을 결정합니다. 활성 프로파일링은 최적화된 발효 조건에서 바이오매스 및 BaCDA 활성을 추정하여 수행됩니다.
    2. 포도당 추정 키트를 사용하여 매체의 포도당 농도를 측정합니다. 발효 시간에 대한 바이오매스, 포도당 농도 및 BaCDA 활성을 사용하여 활성 프로파일을 플롯합니다.

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결과

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CCD(Central Composite Design)를 사용한 E. coli 에서 periplasmic recombinant enzyme chitin deacetylase의 발현 공정 최적화
pET22b-Ba CDA 구축물은 최적화되지 않은 조건에서 성장했을 때 최대 바이오매스 수율 및 BaCDA 활성이 각각 22.26 ± 0.98 g/L 및 84.67 ± 0.56 U/L로 나타났다15. 본 연구에서는 E. coli Rosetta pLysS 세포에서 주위 재조합 효소 키틴 탈아세틸화효소를 발현하기 위한 최적의 공정 조건을 찾기 위해 통계적 접근법 CCD를 채택했습니다. 배양 온도(A), 교반 속도(B), 배양 시간(C), 포도당 농도(D) 및 유당 농도(E)의 5가지 공정 매개변수는 예비 연구를 기반으로 선택되었습니다(표 1). 주위 재조합 효소 키틴 탈아세...

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토론

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탈아세틸화된 키틴질, 키토산은 특히 생물 의학 분야에서 많은 응용 분야를 가지고 있습니다30. 그러나 아세틸화(DA) 정도와 아세틸화 패턴(PA)과 관련된 키토산의 재현성은 다른 환경적 우려와 함께 주요 관심사입니다. 따라서 효소를 사용하는 보다 친환경적인 경로가 개발되었습니다. CDA의 배열은 독특한 탈아세틸화 패턴을 가진 키토산을 생성하는 데 사용될 수 있으며, 이는 생물 의학 응용 분야를 증가시킬 것입니다 4,5. 이전 연구에서 복제된 BaCDA 유전자는 E. coli Rosetta pLysS 세포15에서 발현되었습니다.

BaCDA는 1차 스크리닝에서 37°C에서 개질체로 발현되었습니다. 문헌 조사에 기초하여, 결핵 자동 유도 매체

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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저자는 MAHE UNSW 기금에 대해 Manipal Academy for Higher Education(MAHE)에 감사를 표하고, 저자는 선임 연구 펠로우십, 2019년 3월 31일자 수상 편지 번호 09/1165(0007)2K19 EMR-I에 대해 인도 정부인 과학 및 산업 연구 위원회(CSIR-MHRD)에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Kits
Acetate assay kitMegazyme, IrelandK-ACETAK프로토콜은 96웰 플레이트에서 분석을 수행하기 위해 약간 수정 및 최적화되었습니다
포도당 추정 키트Agappe diagnosis Ltd., India12018013프로토콜은 96웰 플레이트
에서 분석을 수행하기 위해 약간 수정되고 최적화되었습니다.Chemicals
Acetic acidHi-media, IndiaAS001SDS-PAGE 염색 및 destaing 용액
AcrylamideHi-media, 인도MB068SDS-PAGE 젤
Ammonium pursulphateHi-media, 인도MB003준비에 사용 SDS-PAGE 젤
Bis-acrylamideHi-media 준비에 사용, 인도MB005SDS-PAGE 젤
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, 인도MB092SDS-PAGE 염색 및 destaing 용액 준비에 사용
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, 인도MB153Bardford의 분석 준비에 사용
에틸렌 글리콜 키토산Sigma-aldrich, 미국E1502에틸렌 글리콜 키틴을 제조하는 데 사용되며 에틸렌 글리콜 키틴은 효소 반응
D-glucoseHi-mediaMB037배지 성분으로 사용되었습니다.
ImidazoleHi-media, IndiaGRM1864용해 완충액
LactoseHi-media, IndiaGRM017배지 성분으로 사용됩니다.
메탄올Finar, 인도30930LC250SDS-PAGE 염색 및 destaing 용액 준비에 사용
염화나트륨 (NaCl)Hi-media, 인도MB023용해 완충액
인산Hi-media, 인도MB157Bardford의 분석 준비에 사용
sodium dodecyl sulfate (SDS)Hi-media, IndiaGRM6218SDS-PAGE 젤 준비에 사용
인산나트륨 이염기성 무수Hi-media, 인도MB024효소 반응을 위한 배지 및 완충액을 위한 TB sald를 제조하는 데 사용됩니다.
인산 나트륨 일 염기성 무수Hi-media, 인도GRM3964배지 용 TB sald 및 효소 반응을위한 완충액을 준비하는 데 사용됩니다.
테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)하이미디어, 인도MB026SDS-PAGE 젤
트리스 베이스, 인도MB029SDS-PAGE 젤
트립톤하이미디어, 인도RM7707배지 성분으로 사용됨.
효모 추출물Hi-media, 인도RM027배지 성분으로 사용됩니다.
Equipment
AlphaImager HP 젤 문서화 유닛ProteinSimple, USA92-13823-00SDS-PAGE 사진 캡처에 사용
Benchtop mixerEppendorf, Germany 9.776 660, 인도에서 효소 반응을 유지하는 데 사용
에서 세균 배양을 배양하는 데 사용됩니다
.6135000009모든 분광 판독을 수행하는 데 사용
냉각 원심분리기Eppendorf, Germany 5805000017배양액, 용해물 및 기타 모든 원심분리 프로토콜을 원심분리하는 데 사용됩니다
Dry bathLabnet International, USAS81522039SDS-PAGE 마이크로피펫의 단백질 샘플을 변성시키는 데 사용됩니다
.Eppendorf, Germany 3123000900부피 측정을 위한 프로토콜 사용
로커 셰이커Trishul 기기, 인도11770719
SDS-PAGE 장치Bio-Rad, 미국1658001FCSDS-PAGE 젤 캐스팅 및 실행을 위해 SDS-PAGE 젤을 흔드는 데 사용
Ultra-Sonicator Sonics & Materials, Inc., 미국VCX 130울트라 초음파 처리로 박테리아 세포를 용해하는 데 사용
계량 저울Sartorius, 독일BSA124 S프로토콜 전체에서 중량을 측정하는 데 사용
Devices
Nanosep Omega Membrane (3 kDa)이있는 원심 장치PALL 생명 과학, 미국OD003C33기질 후 효소를 분리하는 데 사용됩니다. MINITAB
에서SoftwaresVersion
; (체험판)  펜실베니아 주립 대학은실험 모델을 설계하고 데이터를 분석하는 데 사용됩니다
ImageJ1.53oNational Institutes of Health (NIH)SDS-PAGE를 사용하여 발현 수준을 분석하는 데 사용됩니다 image
Plasmid
pET22b (+) DNA — NovagenMerck- Millipore, USA69744저장 & 마이너스; 20 ° C
Cells
E. coli Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, USA70956Luria&ndash에서 유지 관리; Bertani (LB) 국물은 &-inus에서 25 % 글리세롤을 함유하고 있습니다. 80 > 씨
의 기질로 사용되었으며, 인도 은 에 사용 제조에 사용됨 2 mL 어댑터 Bioincubator shaker Trishul 기기 13410622 다른 온도와 RPM Biospectrophotometer Eppendorf, Germany 17.0개발한 treatment

참고문헌

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