본 논문에서는 생체 조직에서 현장에서 광도를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 작업에는 다양한 방사도 및 방사 조도 측정을 위한 마이크로 스케일 프로브 구성에 대한 세부 정보가 포함되어 있으며, 방사도 특성화를 위한 조직 장착에 대한 지침을 제공하고, 결과 데이터를 분석하기 위한 계산 방법을 간략하게 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유기체는 주로 외부 조직 층이 입사광에 강하게 산란되기 때문에 불투명하게 보입니다. 혈액과 같은 강하게 흡수되는 색소는 전형적으로 좁은 흡광도를 가지므로, 흡광도 피크 바깥쪽의 빛의 평균 자유 경로는 상당히 길 수 있다. 사람들은 조직을 통해 볼 수 없기 때문에 일반적으로 뇌, 지방, 뼈와 같은 조직에는 빛이 거의 또는 전혀 포함되어 있지 않다고 상상합니다. 그러나 광반응성 옵신 단백질은 이러한 많은 조직 내에서 발현되며 그 기능은 잘 알려져 있지 않습니다. 조직 내부의 광채도 광합성을 이해하는 데 중요합니다. 예를 들어, 대왕조개는 강하게 흡수하지만 조직 깊숙이 조밀한 조류 개체군을 유지합니다. 퇴적물 및 생물막과 같은 시스템을 통한 빛 전파는 복잡할 수 있으며 이러한 커뮤니티는 생태계 생산성에 주요 기여자가 될 수 있습니다. 따라서 생체 조직 내부의 이러한 현상을 더 잘 이해하기 위해 스칼라 방사 조도(점을 교차하는 광자 플럭스)와 하강 방사 조도(평면을 수직으로 가로지르는 광자 플럭스)를 측정하기 위한 광학 마이크로 프로브를 구성하는 방법이 개발되었습니다. 이 기술은 현장 실험실에서도 다루기 쉽습니다. 이 마이크로 프로브는 열로 당겨진 광섬유로 만들어지며 당겨진 유리 피펫에 고정됩니다. 프로브의 각도 수용을 변경하기 위해 이산화 티타늄과 혼합 된 UV 경화 에폭시의 10-100 μm 크기의 구를 당겨지고 다듬은 섬유의 끝에 고정합니다. 프로브는 생체 조직에 삽입되고 그 위치는 미세 조작기를 사용하여 제어됩니다. 이 프로브는 10-100 μm의 공간 분해능 또는 단일 세포 규모에서 현장 조직 복사도를 측정할 수 있습니다. 이 프로브는 살아있는 마우스의 피부 아래 4mm에 도달하는 지방과 뇌 세포에 도달하는 빛을 특성화하고 살아있는 조류가 풍부한 거대 조개 조직 내에서 비슷한 깊이에 도달하는 빛을 특성화하는 데 사용되었습니다.
서론
놀랍게도 육상 동물과 얕은 바다 생물은 시각 생리학과 광합성을 위해 몸 안에 충분한 빛을 가지고 있습니다. 예를 들어, 마우스 머리 중앙의 빛 수준(강한 헤모글로빈 흡광도 밴드 외부)은 외부 세계에 비해 3-4배 정도 감쇠됩니다. 이것은 대략 실내와 실외의 조도 차이입니다. 따라서 강한 산란으로 인한 조직 또는 재료의 불투명도는 강한 광 흡수로 인한 불투명도와 동일하지 않습니다. 빛은 세포와 입자가 고농축된 수생 시스템을 통해 전파되는 빛과 유사하게 강한 전방 산란 시스템에서 장거리로 계속 전파될 수 있습니다1. 이 관찰은 옵신 단백질이 모든 동물의 모든 조직에서 거의 유비쿼터스하게 발현된다는 사실에 비추어 특히 두드러집니다. 따라서 생체 조직 내에서 빛이 어떻게 그리고 어디서 감쇠되고 산란되는지 이해하는 것이 중요합니다. 그러나 수생 시스템과 달리 살아있는 조직이있는 경우 기기를 물기둥에 담그고 방사도 및 방사 조도 측정을 얻는 것이 불가능하며 새로운 기술이 필요합니다.
생체 조직의 흡수 및 산란 특성을 특성화하기 위해 이전에 사용된 다른 방법으로는 조직 반사율 프로브 및/또는 적분구(2, 3) 측정, 주사 공초점 현미경(scanning confocal m....
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프로토콜
이 연구는 척추동물 및 무척추동물 연구에 관한 Yale University의 모든 관련 윤리 규정을 준수합니다.
1. 광학 마이크로 프로브 제작
- 유리 슬리브 제작, 재질: 파스퇴르 피펫, 5.75인치( 재료 표 참조)
- 장착 가능한 앨리게이터 클립(재료 표)을 사용하여 테이퍼진 끝이 바닥을 향하고 피펫의 방향이 바닥에 수직이 되도록 넓은 끝으로 유리 피펫을 장착합니다.
- 50g의 플라스틱 바이스 그립(재료 표)을 피펫의 테이퍼 끝에서 걸어 놓습니다. 미끄러짐을 방지하기 위해 피펫과 바이스 그립 사이에 전기 테이프 패드를 놓습니다.
- 작은 부탄 토치(Table of Materials)를 사용하여 피펫의 테이퍼진 끝을 가열합니다. 바이스 그립보다 1cm 위에 화염을 가합니다. 불꽃의 가장 밝은 부분이 유리에서 3cm 떨어져 있고 유리가 불꽃 끝에 오도록 횃불을 잡습니다. 피펫의 길이가 약 5인치 증가하면 즉시 불을 제거하십시오.
- 작은 가위나 유리 절단기를 사용하여 새 당겨진 직경이 다음 섹션에서 사용된 광섬유의 약....
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결과
이 프로토콜은 하강 조도(한 방향에서 한 지점에 도달하는 빛)를 측정하는 데 사용할 수 있는 마이크로 광학 프로브를 구성하거나 광 산란 구형 팁을 추가하여 스칼라 복사 조도(모든 방향에서 한 지점에 도달하는 빛)를 측정하는 절차를 설명합니다. 이 프로브는 살아있는 조직 내부의 단일 세포 길이 척도에 접근하는 공간 분해능에서 방사 조도를 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 기술된 프로브를 사용하여 조도 측정을 위한 조직 샘플을 제조하기 위한 대표적인 방법 및 데이터 보기 및 분석을 위한 대표적인 방법을 설명한다.
그림 1 은 마이크로 프로브 생산의 출력을 보여줍니다. 잡아당길 때 광섬유는 약 3cm 정도 가늘어져야 하며 테이퍼를 따라 흠집이 없어야 합니다. 또한 끝이 평평해야 하며 직경이 15-30μm여야 합니다(그림 1D). 팁의 평탄도는 카보 런덤 종이로 끝을 샌딩하.......
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토론
이 프로토콜은 대략 단일 세포 규모의 공간 분해능을 가진 대량의 생체 조직을 통해 광학 환경을 체계적으로 특성화하는 기술을 설명합니다. 이 저렴하고 유연하며 다루기 쉬운 방법은 살아있는 시스템 내에서 빛의 전파를 연구하는 모든 연구자에게 유용 할 수 있습니다. 경험에 비추어 볼 때, 기존의 방법7과 비교했을 때, 이러한 프로브는 구축에 약간의 연습과 기술이 필요하지만 조직 손상이 적고 더 많은 양의 조밀한 조직을 보다 포괄적으로 특성화할 수 있습니다.
이 방법은 네 부분으로 구성됩니다. 프로브 제작의 첫 번째 부분은 이전 장치 설계10,11에서 영감을 받았습니다. 현재의 접근법은 당겨진 유리 바늘이 세포 사이를 부드럽게 미끄러질 수 있기 때문에 두꺼운 조직 전체를 체계적이고 덜 파괴적인 스캔을 위해 개발되었습니다. 또한 현장 실험실<.......
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공개 사항
이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 Jorgensen 박사의 동료와 그의 연구를 소개해 준 Sanaz Vahidinia에게 감사드립니다. 이 연구는 육군 연구실(번호 W911NF-10-0139), 해군 연구실(MURI 수상 번호 N00014-09-1-1053) 및 NSF-INSPIRE 상 NSF-1343158의 보조금으로 지원되었습니다.
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참고문헌
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood ....
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