방법 논문

Pre-RNA Splicing 분석: 기초 과학에서 응용 연구까지

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DOI:

10.3791/64630

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2022년 9월 12일

1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. 비드에 galectin-3-u1 snrnp 복합체에 의한 접합 활동의 보완. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (166), e61990 (2020).

Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. 스플라이싱 효율을 모니터링하기 위한 리포터 기반 세포 분석법입니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (175), e63014 (2021).

van der Feltz, C. ACT1-CUP1 분석은 발아 효모에서 스플라이소좀 돌연변이의 기질 특이적 민감도를 측정합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (184), e63232 (2022).

Carvalho, F. A., Barros, M. R. A., Girotto, T. P. F., Perona, M. G., Oliveira, C. C. saccharomyces cerevisiae 스플라이소좀 하위 복합체의 일시적인 상호 작용자 검출을 위한 grafix 활용. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (165), e61994 (2020).

Basei, F. L., Moura, L. A. R., Kobarg, J. E1a minigene 도구를 사용하여 mRNA 접합 변화를 연구합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (170), e62181 (2021).

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. 포유류 세포의 인트론 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (184), e63498 (2022).

사설

진핵생물 세포 표현형의 주요 동인 중 하나는 유전자 발현입니다. 유전자 발현의 제어는 필수적이며 전사에서 번역 과정에 이르기까지 여러 단백질과 RNA에 의존합니다1. 이러한 단계를 따라 변경하면 여러 가지 질병을 유발할 수 있습니다. RNA 처리 및 스플라이싱은 성숙한 RNA 분자 2,3,4,5 생성을 담당하는 중요한 반응 그룹을 구성합니다. 스플라이싱은 인트론을 제거하고 엑손을 결합하여 기능적 및 구조적 활동을 수행할 수 있는 성숙한 RNA 분자를 생성합니다. 접합의 효율성과 속도는 다양한 조건에서 관찰되는 표현형에 큰 영향을 미칩니다6.

스플라이싱은 5개의 snRNA와 100개 이상의 단백질로 구성된 스플라이소좀이라는 복잡한 거대분자 기계에 의해 수행됩니다 5,7. 핵심 단백질 성분 외에도 스플라이세오좀에는 이 과정의 조절에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 트랜스 작용 단백질이 있습니다 8,9. 접합의 중요성은 신경퇴행성 장애, 신경근 질환 및 여러 유형의 암을 포함하여 이 과정의 변화로 인해 발생하는 광범위한 질병에 반영됩니다 3,10,11. 스플라이싱 역학 및 스플라이소좀 조립에 대한 연구는 이러한 장애의 생물학에 대한 이해에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

스플라이소좀 조립은 U1 snRNP와 최근에 전사된 pre-mRNA의 특정 영역인 5' 스플라이스 부위 5,8의 연관성으로 시작됩니다. U1 snRNA에 의한 5' 스플라이스 부위의 효율적인 페어링 및 인식은 사용해야 하는 스플라이스 부위를 정의할 뿐만 아니라 어떤 pre-RNA가 먼저 또는 더 효율적으로 접합될 것인지를 제어합니다 6,12,13. 서로 다른 스플라이스 부위를 사용하면 동일한 유전자로부터 성숙한 RNA의 여러 대체 이소형을 생성할 수 있습니다. 선택적 스플라이싱은 단백질체 다양성의 주요 원천으로, 발달 중 또는 다른 세포 및 조직에서 필요한 RNA 및 단백질의 생성을 허용합니다14,15. 대체 RNA 전사체는 질병을 유발할 수 있는 잘리거나 기능하지 않는 단백질 이소형을 생성할 수 있습니다10,16. 따라서 U1 snRNP 복합체의 단백질 성분은1 접합에 중요한 조절 역할을 합니다. 갈렉틴-1 및 갈렉틴-3(Gal1 및 Gal3)은 U1 snRNP17,18의 구성 요소입니다. Voss et al.19는 U1이 고갈된 세포에서 스플라이싱 활성을 구출할 수 있는 Gal3-U1 snRNP 농축 복합체를 얻기 위한 핵 추출물 분획 방법을 제안합니다. 이 분석은 스플라이소좀에 대한 Gal3 결합 메커니즘을 이해하는 데 기여하며, 유사한 접근법을 사용하여 다른 잠재적인 스플라이싱 조절 단백질을 탐색할 수 있습니다.

U1 snRNP와 5' 스플라이스 부위의 결합은 스플라이싱 충실도의 중요한 매개체입니다20. 5' 스플라이스 부위의 돌연변이는 중요하며 U1 snRNP 쌍의 손실을 유발하여 스플라이싱 결함을 초래합니다2. 예를 들어, 낭포성 섬유증은 CFTR 유전자의 돌연변이 5' 스플라이스 부위에 의해 발생합니다21. Wonget al.22 는 U1 snRNA의 상보적 돌연변이로 5' 스플라이스 부위 돌연변이를 보상하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 엑손 포함을 성공적으로 촉진하여 성숙한 RNA를 생성하고 스플라이싱 결함으로부터 구출합니다. 이러한 질병에 대해 가능한 RNA 기반 치료법을 제공하는 것 외에도, 이 접근법은 pre-mRNA의 개별 조절 서열을 분석하는 데 유용할 수 있습니다23.

스플라이스 부위에 대한 U1 snRNA 결합의 충실도는 van der Feltz24에 의해 효모 모델 시스템에서도 탐구되었습니다. 발아 효모 Saccharomyces cerevisiae 는 스플라이싱 동역학 및 스플라이세오좀 조립을 탐구하는 데 널리 사용되었습니다25. 스플라이싱 동역학 및 스플라이세오좀 조성은 진핵생물에서 잘 보존되어 있으며, 효모는 조립 중 중간 복합체의 형성을 모니터링하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다26. ACT1-CUP1 리포터 분석은 한 쌍의 유전자, 즉 최적의 스플라이스 부위 서열을 가진 하나의 인트론을 포함하는 ACT1과 구리 킬레이트제를 발현하는 CUP1의 발현을 기반으로 하며, 이 금속 이온으로 인한 손상으로부터 세포를 보호합니다. CUP1은 ACT1이 올바르게 접합된 경우에만 표현되므로, 리포터 시스템(27)을 생성한다. 구리 농도가 다른 조건에서 세포 성장을 모니터링하여 서로 다른 인트론 서열 또는 서로 다른 조절 단백질의 스플라이싱 효율을 해결할 수 있습니다. van der Feltz24 는 이 리포터 시스템과 구리 생존율 분석을 사용하여 스플라이싱 조절 단백질의 효과를 분석하는 방법을 제시합니다. 유사한 접근 방식을 사용하여 효모의 스플라이싱 성공을 해결하기 위해 다양한 단백질과 함께 인트론 서열의 변형을 설계할 수 있습니다.

snRNP 결합 외에도 단백질의 결합은 스플라이소좀 조립동안 필수적입니다 1. 스플라이소좀 활성의 제어는 단백질 구성과 형성 중에 발생하는 상호 작용에 직접적으로 의존합니다. 단백질 성분의 구조적, 기능적 특성은 복합체를 활성화하는 데 중요합니다 5,7. Carvalho et al.28은 글리세롤 구배 분석에서 비가역적 단백질 가교에 의존하는 Grafix 방법을 기반으로 하는 접근 방식을 사용합니다. 이 분석은 단백질의 구성과 조립 중에 발생하는 일시적인 상호 작용을 다루며, 이는 활성 복합체의 조립과 접합 성공에 중요할 수 있습니다. 이 접근 방식을 사용한 다른 동적 거대 분자 복합체의 분석은 매우 유용할 수 있으며 단백질 조직 및 상호 작용에 대한 통찰력을 제공합니다.

스플라이싱의 화학적 성질과 속도는 또한 서로 다른 스플라이소좀 성분의 동적 연관성에 의해 영향을 받는다8. 최근에, 소분자 스플라이싱 억제제의 사용은 스플라이싱 반응의 속도 감소로 인해 시험관 내에서 특정 단계가 정체될 수 있음을 밝혀냈습니다29,30. Basei et al.31은 스플라이싱 조절 인자인 Nek4의 영향에 대한 선택적 스플라이싱을 분석하는 방법을 제시합니다. 미니유전자를 사용하여 HEK293 세포에서 전사 또는 항종양 표현형을 유발하는 전사체 이소형의 유병률이 다루어집니다. 스플라이싱의 잘못된 조절 또는 스플라이스 부위의 다른 사용은 대체 전사체 생성으로 이어져 다양한 유형의 암을 유발할 수 있습니다16. 치료 중 스플라이싱 조절제 또는 억제제를 사용하면 스플라이스 부위 선택을 결정할 수 있으므로 프로종양 또는 항종양 여부에 관계없이 생성된 대체 이소형을 정의할 수 있습니다. 파클리탁셀과 시스플라틴은 현재 화학요법제로 사용됩니다. E1A 미니유전자를 사용하면 선택적 접합에서 이러한 약물의 효과가 해결됩니다. 미니유전자를 사용한 선택적 스플라이싱 분석은 치료 및 특정 약물 사용에 대한 트랜스 작용 단백질 및 스플라이싱 변화의 영향을 모니터링하는 중요한 전략입니다.

이 계통에서 많은 인트론 마이크로RNA(miRNA)가 종양 표현형과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다32,33. 인트론 miRNA 합성 및 생물 발생의 제어 및 조절은 스플라이싱 반응의 제어와 연관될 수 있습니다. miRNA는 세포에서 mRNA의 안정성과 유병률을 조절하여 RNA 안정성과 번역 속도에 영향을 미칠 수 있습니다34 . Gatti da Silva와 Coltri35는 세포 표현형의 변화 및 프로 또는 항종양 특성의 결정과 직접적으로 연결될 수 있는 인트론 miRNA 생물 발생 및 성숙을 평가하기 위한 리포터 시스템을 설명합니다. 스플라이싱 조절 단백질 HuR의 조절을 통해 이 시스템은 인트론 발암성 miRNA의 생물 발생 및 기능적 활성을 분석할 수 있습니다.

사전 RNA 스플라이싱 분석과 특정 세포에서 다양한 RNA의 성숙은 게놈 정보를 이해하고 해석하는 데 필수적입니다. 효모와 포유류 스플라이소좀은 보존되어 있으며 기초 연구는 치료 및 생물 의학에 적용되는 다양한 방법의 사용을 개선할 수 있습니다. 현재 이용 가능한 많은 양의 게놈 데이터에도 불구하고 표현형에서 이 정보의 발현은 세포 특이적일 수 있으며 RNA 처리 및 스플라이싱에 의존할 수 있습니다. 이 과정의 복잡한 규제를 이해하는 것은 향후 연구에 필수적입니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 FAPESP(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) 보조금 번호 2019/21874-5와 Universidade de São Paulo의 지속적인 연구 지원에 감사를 표합니다.

참고문헌

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Lührmann, R. The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Reviews Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends in Molecular Medicine. 18 (8), 472-482 (2012).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 291(2020).
  6. Fu, X. D., Ares, M. Context-dependent control of alternative splicing by RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 689-701 (2014).
  7. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  8. Will, C. L., Lührmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003703(2011).
  9. Jurica, M. S., Moore, M. J. Pre-mRNA splicing: Awash in a sea of proteins. Molecular Cell. 12 (1), 5-14 (2003).
  10. Coltri, P. P., dos Santos, M. G. P., da Silva, G. H. G. Splicing and cancer: Challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (3), 1527(2019).
  11. Havens, M. A., Duelli, D. M., Hastings, M. L. Targeting RNA splicing for disease therapy. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (3), 247-266 (2013).
  12. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  13. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  14. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: A pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  15. Lee, Y., Rio, D. C. Mechanisms and regulation of alternative pre-mRNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 84, 291(2015).
  16. Dvinge, H., Kim, E., Abdel-Wahab, O., Bradley, R. K. RNA splicing factors as oncoproteins and tumour suppressors. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 413-430 (2016).
  17. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17 (8), 4730-4737 (1997).
  18. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (4), 1213-1217 (1995).
  19. Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of splicing activity by a galectin-3-u1 snrnp complex on beads. Journal of Visualized Experiments. (166), e61990(2020).
  20. Shao, W., Kim, H. -S., Cao, Y., Xu, Y. -Z., Query, C. C. A U1-U2 snRNP interaction network during intron definition. Molecular and Cellular Biology. 32 (2), 470-478 (2012).
  21. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), 2114886119(2022).
  22. Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency. Journal of Visualized Experiments. (175), e63014(2021).
  23. Hamid, F. M., Makeyev, E. v A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  24. vander Feltz, C. ACT1-CUP1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (184), e63232(2022).
  25. Plaschka, C., Newman, A. J., Nagai, K. Structural basis of nuclear pre-mRNA splicing: Lessons from Yeast. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032391(2019).
  26. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: methods, mechanisms, and machinery. Methods in Enzymology. 351, 200-220 (2002).
  27. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  28. Carvalho, F. A., Barros, M. R. A., Girotto, T. P. F., Perona, M. G., Oliveira, C. C. Utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes. Journal of Visualized Experiments. (165), e61994(2020).
  29. Effenberger, K. A., Urabe, V. K., Jurica, M. S. Modulating splicing with small molecular inhibitors of the spliceosome. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 8 (2), 1381(2017).
  30. Corrionero, A., Miñana, B., Valcárcel, J. Reduced fidelity of branch point recognition and alternative splicing induced by the anti-tumor drug spliceostatin A. Genes and Development. 25 (5), 445-459 (2011).
  31. Basei, F. L., Moura, L. A. R., Kobarg, J. Using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes. Journal of Visualized Experiments. (170), e62181(2021).
  32. Volinia, S., et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2257-2261 (2006).
  33. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
  34. Bartel, D. P. Metazoan microRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
  35. Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A reporter assay to analyze intronic microRNA maturation in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (184), e63498(2022).

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