Method Article

Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)

DOI:

10.3791/64633

February 17th, 2023

In This Article

Summary

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현재 프로토콜은 1차 조직(피부, 폐포, 기도 및 장)의 전층 장기 온칩 배양의 성공적인 확립 및 성숙을 위한 Open-Top Organ-Chip의 기능과 필수 배양 양식을 설명하여 시험관 내에서 인간 상피/중간엽 및 혈관 틈새 인터페이스의 다양한 기능적 측면을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.

Abstract

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거의 모든 인간 장기에는 3차원(3D) 구조로 구성된 밀접하게 연결된 세포의 하나 또는 여러 층으로 구성된 상피 조직이 늘어서 있습니다. 상피의 주요 기능 중 하나는 밑줄 조직을 물리적 및 화학적 손상 및 감염원으로부터 보호하는 장벽을 형성하는 것입니다. 또한 상피는 영양소, 호르몬 및 기타 신호 분자의 수송을 매개하여 종종 장기 내에서 세포 위치 지정 및 구획화를 안내하는 생화학적 구배를 생성합니다. 장기 구조와 기능을 결정하는 중심적인 역할로 인해 상피는 동물 모델에 의해 항상 포착되지 않는 많은 인간 질병에 대한 중요한 치료 표적입니다. 명백한 종 간 차이 외에도 동물에서 상피의 장벽 기능 및 수송 특성에 대한 연구 연구는 살아있는 시스템에서 이러한 조직에 접근하는 것이 어렵기 때문에 더욱 복잡해집니다. 2차원(2D) 인간 세포 배양은 기본적인 과학적 질문에 답하는 데 유용하지만 생체 내 예측이 좋지 않은 경우가 많습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 지난 10년 동안 장기 온 칩(organs-on-a-chip)으로 알려진 수많은 마이크로 엔지니어링 생체 모방 플랫폼이 전통적인 체외 및 동물 실험에 대한 유망한 대안으로 부상했습니다. 여기에서는 피부, 폐 및 내장을 포함한 장기 특이적 상피 조직을 모델링하기 위해 설계된 플랫폼인 Open-Top Organ-Chip(또는 Open-Top Chip)에 대해 설명합니다. 이 칩은 기계적 활성 시스템 내에 조직 특이적 섬유아세포와 내피 세포를 통합하여 3D 기질 구성 요소를 재현하는 기능을 포함하여 상피 조직의 다세포 구조와 기능을 재구성할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 이 Open-Top Chip은 단일 세포에서 다층 조직 구조에 이르기까지 여러 규모의 해상도에서 상피/중간엽 및 혈관 상호 작용을 연구하기 위한 전례 없는 도구를 제공하여 건강 및 질병에서 상피 기관의 세포 간 누화의 분자 해부를 가능하게 합니다.

Introduction

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역사적으로 과학자들은 신약 개발을 위해 전임상 동물 실험에 의존해 왔지만, 인간 결과와의 상관관계가 낮기 때문에 이러한 방법에 의문이 제기되는 경우가 점점 늘어나고 있다1. 동물 실험을 대체, 감소 및 개선하기 위한 "3Rs" 원칙의 구현은 과학자들이 전임상 약물 및 화학 독성 위험 평가를 지원하기 위한 새로운 체외 대체 방법을 찾도록 촉구합니다2. 그러나 현재까지 개발된 많은 체외 모델에는 인간 생체 기관의 역동적인 특성을 요약하는 데 필요한 생물학적 구조, 세포 복잡성 및 기계적 환경이 부족합니다 3,4.

기존의 체외 전임상 시스템은 일반적으로 단단한 플라스틱 표면에서 성장한 인간 세포의 2D 단일 배양을 사용합니다. 이러한 방법은 간단한 기계론적 연구를 수행하고 약물 후보를 신속하게 스크리닝할 수 있는 도구를 제공합니다. 상대적으로 저렴한 비용과 높은 견고성으로 인해 2D 모델은 종종 자동 고처리량 시스템과 쌍을 이루며 약물 개발 프로세스 5,6

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Protocol

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인간 콜로노이드는 신시내티 아동 병원의 기관 생물 안전위원회 (IBC 2017-2011)의 지침에 따라 장 절제술에서 얻었습니다.

1. 표면 활성화

  1. 활성화 완충액의 제조
    1. 가교제와 용매 완충 시약을 생물안전 캐비닛(BSC) 아래에 놓고 사용하기 전에 실온(RT)에서 10분 동안 평형을 이루도록 합니다.
    2. 가교제 용액을 직사광선 노출로부터 보호하기 위해 멸균 광 불투과성 용기 또는 알루미늄 호일로 싸인 투명한 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 용매 완충액 5mL에 가교제 5mg을 재구성합니다.
    3. 용액을 1분 동안 와동시켜 모든 덩어리를 제거한 다음, 50 μL의 가교결합제 용액을 칩의 하단 채널에 직접 피펫팅하고 150 μL를 개방된 상단 챔버 내로 피펫팅한다.
    4. 흡열기를 사용하여 칩 표면에서 과도한 가교 용액을 제거합니다. 그런 다음 추가로 50 μL의 가교 용액을 칩의 하단 채널에 직접 피펫하고 150 μL를 개방형 상단 챔버에 넣어 남아 있는 기포를 제거합니다.
  2. UV 가교 기계로 활성화
    1. BSC 아래의 칩에서 뚜껑을 부드럽게 제거하고 멸균 용기에 보관하십시오.
    2. ....

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Results

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표면 마이크로패터닝
세포외 기질(ECM)의 마이크로패터닝은 장 음와 인터페이스의 공간 구성을 복제하는 데 사용할 수 있습니다. Open-Top Chip 구성은 결장 상피-기질 경계면(그림 6A,B)과 마이크로미터 규모의 장 선와(그림 6C-E)의 자연 지형을 모방하도록 특별히 설계된 미세 패턴 스탬프를 통합하도록 수정할 수 있습니다. 우리는 피부, 기도 및 폐포 모델에 대해 평평한(패턴이 없는) 표면을 사용했다는 점에 유의하십시오. 이 경우 상피세포에 씨드하여 균일한 하이드로젤 표면을 얻기 위해 스탬프를 사용하였다. 우리는 장 점막의 자연 구조를 모방할 수 있는 디자인을 선택했으며, 장 내부를 모방한 양성 돔과 음성 돔의 교대로 구성되었습니다.

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Discussion

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Open-Top Chip은 제어된 미세 환경에서 내피, 간질 및 상피 사이에서 발생하는 복잡한 세포 상호작용을 실시간으로 조사할 수 있는 플랫폼을 나타냅니다. 이 기술은 유체 전단(흐름), 순환 스트레칭 및 마이크로패터닝을 통해 달성된 상피 표면 지형의 재구성을 포함하여 인체 조직 미세 환경을 재구성하는 것과 관련된 물리적 및 생화학적 단서의 통합과 같은 기존의 기관형 및 오가노이드 배양에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 이 플랫폼 내에서 성장하는 인간 세포는 상부 및/또는 하부 구획에서 유출된 유체(또는 유출물)를 사용하는 면역 조직화학 및 생화학적 분석을 포함한 기존 기술을 통해 분석할 수 있는 조직 특이적 기능을 요약하기 위해 시너지 효과를 발휘합니다. 현재의 디자인은 세포가 조직 특이적 섬유아세포 및 기타 간질 세포와 직접 접촉하여 성장하는 상피층에 쉽게 접근할 수 있도록 하여 상피 조직의 다세포 구조를 모방합니다. 특히, Open-Top Chip 프로토타입은 다른 장기 칩 플랫폼의 사용과.......

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Disclosures

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저자는 잠재적인 경쟁 이익으로 간주될 수 있는 다음과 같은 재정적 이해관계/개인적 관계를 선언합니다. Varone Antonio는 Emulate Inc.의 전 직원이며 Emulate의 지분을 보유할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EMEM 10개 Lonza12-684F중간; Stroma
18 게이지 바늘MicroGroup316H18RW튜브 스테인레스 스틸 316 용접, 18RW 풀 하드 
19 게이지 바늘MicroGroup316H19RW튜브 스테인레스 스틸 316 용접, 19RW 풀 하드
2-Stop PharMed BPT 콜-팔머 EW-95723-12튜브, 0.25 mm, 12/팩
70% 에탄올 및 와이프  -  - 표면 살균용 
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)SigmaB7880미디엄 보충제 
가-83-01 토크리스 2939
아데닌시그마A9795
고급 DMEM/F12 Thermo12634010
Airway 상피 세포Lifeline Cell TechnologyFC-0016
알루미늄 호일  -  -  -
폐포 세포세포 생물학적 제제H6621
Anti-ABCA3   ABCAM AB24751 마우스 단클론 항체 [3C9] 
안티-아쿠아포린5 알렉사 플루어 647 ABCAM AB215225   토끼 단클론 항체 [EPR3747]   
안티-아쿠아포린5 ABCAM AB92320 토끼 단클론 항체 [EPR3747] 
안티 베타 IV 튜뷸린   ABCAM AB11315 마우스 단클론 항체 [ONS.1A6] 
안티-CD31 (PECAM-1) ABCAM AB9498 마우스 단클론 [JC/70A] 항체   
안티-CK5   ABCAM AB75869 토끼 재조합 단클론 [AY1E6] 
항-사이토케라틴 10   써모피셔 MA5-13705 마우스 단클론 항체 (DE-K10) 
항-사이토케라틴 14   ABCAM AB7800 마우스 단클론 항체 
안티-E-Cadherin   ABCAM AB1416   마우스 단클론 항체 
안티 필라그린   써모피셔 PA5-79267 토끼 다클론 항체   
안티-HTI-56 테라스 바이오테크 TB-29AHT1-56   마우스 단클론 항체(IgG1) 
안티-HTII-280 테라스 바이오테크 TB-27AHT2-280 마우스 단클론 항체(IgM) 
안티-인볼루크린   써모피셔 MA5-11803 마우스 단클론 항체(SY5) 
안티 이소폼 TA p63-α, -β, -γ    바이오렝겐트 618902 토끼 다클론 항체   
안티-Ki67   ABCAM AB8191 마우스 단클론 항체 [B126.1] 
안티-램프3   ABCAM AB111090 토끼 다클론 항체 
안티-미성숙 SP-B 세븐 힐 WRAB-48604 토끼 다클론 항체 
안티-MUC5AC   써모피셔 PA5-34612 토끼 다클론 항체   
항 뮤신 -2 SantaCruz Biotechnologysc-7314마우스 단클론 항체 (IgG1) 
안티-p63   다코 GA662 마우스 단클론 항체 p63 단백질(Dako Omnis)  클론 DAK-p63 
안티 PCNA   써모피셔 PA5-32541 토끼 다클론 항체   
안티 포도플라닌 (AT-1α)   ABCAM AB128994 토끼 다클론 항체 
Anti-Pro + 성숙한 계면활성제 단백질 B ABCAM AB40876 토끼 다클론 항체 
항-계면활성제 C     세븐 힐   WRAB-9337   토끼 다클론 항체 
항자궁글로빈/SCGB1A1 하이컬트 바이오테크 HM2178 마우스 단클론 항체 [AY1E6] 
안티-VE-cadherin   ABCAM AB33168 토끼 다클론 항체   
안티-ZO-1   써모피셔 33-9100 마우스 단클론 항체 [1A12] 
아스코르브산SigmaA4544
흡인 피펫 코닝 / 팔콘 357558 2 mL, 폴리스티렌, 개별 포장 
흡인 팁  -  - 멸균(오토클레이브) 
B27Thermo17504044
Blocker BSA (10X)   써모피셔 37525년 차단제 
칼슘 클로라이드시그마C7902
CHIR 99021Tocris4423
콜라겐 I어드밴스드 바이오매트릭스513310 mg/mL (Stroma)
콜라겐 I Advanced BioMatrix50053 mg/mL (혈관 ECM)
콜라겐 IV시그마  C5533
콜라겐-IV시그마 C5533-5MG 인간 태반에서 추출한 콜라겐, 5 mg 분말, 1 mg/mL로 재구성;
결장 섬유아세포 세포 생물제제  H6231
결장 미세혈관 내피 세포  세포 생물제제H6203 
원뿔형 튜브    -  - 15 mL 및 50 mL  폴리프로필렌, 멸균 
크로스링커(ER-1) 모방 104615 mg 분말 
DAPI (4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 딜락테이트)   써모피셔 D3571 DNA 프로브 
피부 섬유아세포ATCCPCS-201-010
피부 미세혈관 내피 세포ATCCCRL-3243
덱사메타손시그마D4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM/F-12 지브코 
DMEM/F-12, 글루타MAX   지브코 10565-018 ALI 배지용 기저 배지 
당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 488)   ABCAM AB150105 당나귀 안티-마우스 2차 항체   
당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 568)   ABCAM AB175472 당나귀 안티-마우스 2차 항체 
당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 647)   ABCAM AB150107 당나귀 안티-마우스 2차 항체 
당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 488)   ABCAM   AB150073 당나귀 안티-마우스 2차 항체 
당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 568)   ABCAM AB175470 당나귀 안티-마우스 2차 항체 
당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 647)   ABCAM AB150075 당나귀 안티-마우스 2차 항체 
둘베코' s PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+ 제외) 코닝 21-031-이력서 1배 
표피 성장 인자 (EGF) 인간, 대장재조합 PromoCellC-60170중간 보충제 
F-12 햄' s인비트로젠 21700-108혈관 ECM
FibriCol 고급 바이오매트릭스 5133-20ML 콜라겐-I 용액 (10 mg/mL)
피브로넥틴코닝356008
피브로넥틴, 인간, 자연,   코닝 47743-654 인간 혈장 피브로넥틴 
세밀한 팁 정밀 핀셋 아벤18056미국 Technik 스타일 5B-SA 정밀 스테인리스강 핀셋
글루타맥스인비트로젠 21700-108
글루타맥스 인비트로젠 
염소 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 594)   ABCAM AB150080 염소 안티 마우스 2차 항체   
염소 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 647)   ABCAM AB150115 염소 안티 마우스 2차 항체   
염소 안티 마우스 IgG H& L (핏씨)   ABCAM AB6785 염소 안티 마우스 2차 항체   
염소 안티-마우스 IgG1 알렉사 플루어 568   써모피셔 A-21124 염소 안티-마우스 IgG1 2차 항체 
염소 안티-마우스 IgM Alexa Fluor 488   써모피셔 A-21042 염소 안티-마우스 IgM 2차 항체 
휴대용 진공 흡입기 코닝 4930년  - 
열 비활성화 HyClone FetalClone II 세럼 (FCS) GE Healthcare Life SciencesSH30066.03
혈구계  -  - - 
돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 소금SigmaH3149
HEPESThermo15630080
Human [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
임상 절제인간 콜로노이드임상 절제에서 얻은
인간 EGF 재조합 단백질 PHG0311L
인간 상피 성장 인자 써모 
HyClone FetalClone II 세럼 (미국)  GE 헬스케어 SH30066.02안녕   멸균 FBS  열 비활성화 
하이드로코르티손 21-헤미숙시네이트 나트륨 염시그마H4881
하이드로코르티손 프로모션셀   C-64420 중간 보충제   
얼음 양동이  -  -  - 
이스마텍 IPC-N Cole-PalmerEW-78000-41저속 디지털 연동 펌프; q24-채널 (12개 칩당 1개)
ITESBioWhittaker17-839Z
케라티노세포 성장 인자 (KGF), 또는 Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7)로도 알려져 있음, 인간, HEKPromoCellC-63821
KeratinocytesATCCPCS-200-010
Laminin 바이올라미나CT521-0501 
라미닌, 521 CTG (CT521) 바이올라미나   CT521-0501 인간 재조합 라미닌 521       
폐 섬유아세포생물학 제제H6013
폐 섬유아세포생명선 세포 기술FC-0049
폐 미세혈관 내피 세포LonzaCC-2527
폐 평활근 세포생명선 세포 기술FC-0046
수동 카운터  -  -  -
Masterflex(TPE) 트랜스퍼 튜빙 Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32"
OD 중간 199, 페놀 레드없음 Thermo 
마이크로 원심분리기 튜브  -    -   1.5 mL, 멸균 
현미경 (카메라 포함)  -  - 명시야 이미징용 
N2시그마17502001
N-아세틸 시스테인시그마A5099
노긴 (HEK293T 조건 미디엄)시그마N17001
일반 염소 세럼   써모피셔 50062Z 차단 솔루션   
O-포스포스릴에탄올아민 SigmaP0503
파라포름알데히드(4% wt/vol)   EMS 15710년 고정제 
페니실린 스트렙토마이신GIBCO15140122
페니실린-스트렙토마이신 시그마 P4333 10,000 U/mL; 10 mg/mL 
피펫 팁    -  - P20, P200 및 P1000  멸균, 낮은 접착력
피펫 길슨   F167380 P20, P200 및 P1000 
PluriQ 세럼 교체품 (또는 대체적으로 KO 세럼 교체)AMSBIO (또는 Thermo)N/A (또는 C1910828010)
Poly-L-Lysine 코팅 현미경 유리 슬라이드   시그마 P0425 유리 슬라이드 
PrimocinInvivoGenant-pm-1
프로게스테론시그마P8783
ProLong Gold   써모피셔 P36931 DAPI를 사용한 안티페이드 마운트앤트;
레티노산 SigmaR2625
ROCK 억제제 (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T 조건 미디엄)SigmaSCC111
SAGM SingleQuots 보충제 LonzaCC-4124
SAGMTM 소기도 상피 세포 성장 매체 BulletKitTM 론자 CC-4124 중간 보충제 
SB2001190 토크리스 1264/10
혈청학적 피펫  -  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, 그리고 25 mL 저 내독소, 멸균;
소기도 상피 세포 성장 배지 (SAGM)Lonza CC-4124 
용제 완충액 (ER-2) 모방 1046225 mL 병 
스테리플립-HV MilliporeSE1M003M00멸균 필터링 원뿔형 튜브
sterilin 100 mm 스퀘어 페트리 접시Thermo103멸균, 6개 당 1개 
T25 플라스크  -  -  -
T75 플라스크  -  -  - 
트리-요오드티로닌시그마T5516
트리톤 X-100 (0.3% (vol/vol)   시그마 T8787 투과화제 
트리판 블루 시그마 93595 0.4% 용액 
TrypEE 솔루션 시그마 12604013 세포 분리 솔루션 
트윈-20 시그마 P2287 투과화제 
UV 라이트 오븐 (피크 주파수 365nm, 100 µ의 강도; J/cm2)VWR21474-598UVP, 장거리 UV, 365 nm 60Hz 모델 CL-1000L
진공 설정  -  - 최소 압력: -70 kPa 
혈관 내피 성장 인자 165 (VEGF-165) 인간, 대장재조합 PromoCellC-64420
VEGF-165   프로모션셀   C-64420 중간 보충제 
Von Willebrand Factor conjugated FITC   ABCAM AB8822 양 다클론 항체 
수조(또는 구슬)  -  - 37 °로 설정합니다. 씨 
Wnt3A (L-Wnt3A 조건화 매체)ATCCCRL-2647
PBS 솔루션의 11320082균 35050061에서 얻은PHG031111043023균

References

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L.

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