현재 프로토콜은 1차 조직(피부, 폐포, 기도 및 장)의 전층 장기 온칩 배양의 성공적인 확립 및 성숙을 위한 Open-Top Organ-Chip의 기능과 필수 배양 양식을 설명하여 시험관 내에서 인간 상피/중간엽 및 혈관 틈새 인터페이스의 다양한 기능적 측면을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.
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방법 논문
Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)
이 논문에서
요약
초록
거의 모든 인간 장기에는 3차원(3D) 구조로 구성된 밀접하게 연결된 세포의 하나 또는 여러 층으로 구성된 상피 조직이 늘어서 있습니다. 상피의 주요 기능 중 하나는 밑줄 조직을 물리적 및 화학적 손상 및 감염원으로부터 보호하는 장벽을 형성하는 것입니다. 또한 상피는 영양소, 호르몬 및 기타 신호 분자의 수송을 매개하여 종종 장기 내에서 세포 위치 지정 및 구획화를 안내하는 생화학적 구배를 생성합니다. 장기 구조와 기능을 결정하는 중심적인 역할로 인해 상피는 동물 모델에 의해 항상 포착되지 않는 많은 인간 질병에 대한 중요한 치료 표적입니다. 명백한 종 간 차이 외에도 동물에서 상피의 장벽 기능 및 수송 특성에 대한 연구 연구는 살아있는 시스템에서 이러한 조직에 접근하는 것이 어렵기 때문에 더욱 복잡해집니다. 2차원(2D) 인간 세포 배양은 기본적인 과학적 질문에 답하는 데 유용하지만 생체 내 예측이 좋지 않은 경우가 많습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 지난 10년 동안 장기 온 칩(organs-on-a-chip)으로 알려진 수많은 마이크로 엔지니어링 생체 모방 플랫폼이 전통적인 체외 및 동물 실험에 대한 유망한 대안으로 부상했습니다. 여기에서는 피부, 폐 및 내장을 포함한 장기 특이적 상피 조직을 모델링하기 위해 설계된 플랫폼인 Open-Top Organ-Chip(또는 Open-Top Chip)에 대해 설명합니다. 이 칩은 기계적 활성 시스템 내에 조직 특이적 섬유아세포와 내피 세포를 통합하여 3D 기질 구성 요소를 재현하는 기능을 포함하여 상피 조직의 다세포 구조와 기능을 재구성할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. 이 Open-Top Chip은 단일 세포에서 다층 조직 구조에 이르기까지 여러 규모의 해상도에서 상피/중간엽 및 혈관 상호 작용을 연구하기 위한 전례 없는 도구를 제공하여 건강 및 질병에서 상피 기관의 세포 간 누화의 분자 해부를 가능하게 합니다.
서론
역사적으로 과학자들은 신약 개발을 위해 전임상 동물 실험에 의존해 왔지만, 인간 결과와의 상관관계가 낮기 때문에 이러한 방법에 의문이 제기되는 경우가 점점 늘어나고 있다1. 동물 실험을 대체, 감소 및 개선하기 위한 "3Rs" 원칙의 구현은 과학자들이 전임상 약물 및 화학 독성 위험 평가를 지원하기 위한 새로운 체외 대체 방법을 찾도록 촉구합니다2. 그러나 현재까지 개발된 많은 체외 모델에는 인간 생체 기관의 역동적인 특성을 요약하는 데 필요한 생물학적 구조, 세포 복잡성 및 기계적 환경이 부족합니다 3,4.
기존의 체외 전임상 시스템은 일반적으로 단단한 플라스틱 표면에서 성장한 인간 세포의 2D 단일 배양을 사용합니다. 이러한 방법은 간단한 기계론적 연구를 수행하고 약물 후보를 신속하게 스크리닝할 수 있는 도구를 제공합니다. 상대적으로 저렴한 비용과 높은 견고성으로 인해 2D 모델은 종종 자동 고처리량 시스템과 쌍을 이루며 약물 개발 프로세스 5,6
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프로토콜
인간 콜로노이드는 신시내티 아동 병원의 기관 생물 안전위원회 (IBC 2017-2011)의 지침에 따라 장 절제술에서 얻었습니다.
1. 표면 활성화
- 활성화 완충액의 제조
- 가교제와 용매 완충 시약을 생물안전 캐비닛(BSC) 아래에 놓고 사용하기 전에 실온(RT)에서 10분 동안 평형을 이루도록 합니다.
- 가교제 용액을 직사광선 노출로부터 보호하기 위해 멸균 광 불투과성 용기 또는 알루미늄 호일로 싸인 투명한 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 용매 완충액 5mL에 가교제 5mg을 재구성합니다.
- 용액을 1분 동안 와동시켜 모든 덩어리를 제거한 다음, 50 μL의 가교결합제 용액을 칩의 하단 채널에 직접 피펫팅하고 150 μL를 개방된 상단 챔버 내로 피펫팅한다.
- 흡열기를 사용하여 칩 표면에서 과도한 가교 용액을 제거합니다. 그런 다음 추가로 50 μL의 가교 용액을 칩의 하단 채널에 직접 피펫하고 150 μL를 개방형 상단 챔버에 넣어 남아 있는 기포를 제거합니다.
- UV 가교 기계로 활성화
- BSC 아래의 칩에서 뚜껑을 부드럽게 제거하고 멸균 용기에 보관하십시오.
- ....
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결과
표면 마이크로패터닝
세포외 기질(ECM)의 마이크로패터닝은 장 음와 인터페이스의 공간 구성을 복제하는 데 사용할 수 있습니다. Open-Top Chip 구성은 결장 상피-기질 경계면(그림 6A,B)과 마이크로미터 규모의 장 선와(그림 6C-E)의 자연 지형을 모방하도록 특별히 설계된 미세 패턴 스탬프를 통합하도록 수정할 수 있습니다. 우리는 피부, 기도 및 폐포 모델에 대해 평평한(패턴이 없는) 표면을 사용했다는 점에 유의하십시오. 이 경우 상피세포에 씨드하여 균일한 하이드로젤 표면을 얻기 위해 스탬프를 사용하였다. 우리는 장 점막의 자연 구조를 모방할 수 있는 디자인을 선택했으며, 장 내부를 모방한 양성 돔과 음성 돔의 교대로 구성되었습니다.
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토론
Open-Top Chip은 제어된 미세 환경에서 내피, 간질 및 상피 사이에서 발생하는 복잡한 세포 상호작용을 실시간으로 조사할 수 있는 플랫폼을 나타냅니다. 이 기술은 유체 전단(흐름), 순환 스트레칭 및 마이크로패터닝을 통해 달성된 상피 표면 지형의 재구성을 포함하여 인체 조직 미세 환경을 재구성하는 것과 관련된 물리적 및 생화학적 단서의 통합과 같은 기존의 기관형 및 오가노이드 배양에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 이 플랫폼 내에서 성장하는 인간 세포는 상부 및/또는 하부 구획에서 유출된 유체(또는 유출물)를 사용하는 면역 조직화학 및 생화학적 분석을 포함한 기존 기술을 통해 분석할 수 있는 조직 특이적 기능을 요약하기 위해 시너지 효과를 발휘합니다. 현재의 디자인은 세포가 조직 특이적 섬유아세포 및 기타 간질 세포와 직접 접촉하여 성장하는 상피층에 쉽게 접근할 수 있도록 하여 상피 조직의 다세포 구조를 모방합니다. 특히, Open-Top Chip 프로토타입은 다른 장기 칩 플랫폼의 사용과.......
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공개 사항
저자는 잠재적인 경쟁 이익으로 간주될 수 있는 다음과 같은 재정적 이해관계/개인적 관계를 선언합니다. Varone Antonio는 Emulate Inc.의 전 직원이며 Emulate의 지분을 보유할 수 있습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| EMEM 10개 | Lonza | 12-684F | 중간; Stroma |
| 18 게이지 바늘 | MicroGroup | 316H18RW | 튜브 스테인레스 스틸 316 용접, 18RW 풀 하드 |
| 19 게이지 바늘 | MicroGroup | 316H19RW | 튜브 스테인레스 스틸 316 용접, 19RW 풀 하드 |
| 2-Stop PharMed BPT | 콜-팔머 | EW-95723-12 | 튜브, 0.25 mm, 12/팩 |
| 70% 에탄올 및 와이프 | - | - | 표면 살균용 |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | 미디엄 보충제 |
| 가-83-01 | 토크리스 | 2939 | |
| 아데닌 | 시그마 | A9795 | |
| 고급 DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway 상피 세포 | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| 알루미늄 호일 | - | - | - |
| 폐포 세포 | 세포 생물학적 제제 | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | AB24751 | 마우스 단클론 항체 [3C9] |
| 안티-아쿠아포린5 알렉사 플루어 647 | ABCAM | AB215225 | 토끼 단클론 항체 [EPR3747] |
| 안티-아쿠아포린5 | ABCAM | AB92320 | 토끼 단클론 항체 [EPR3747] |
| 안티 베타 IV 튜뷸린 | ABCAM | AB11315 | 마우스 단클론 항체 [ONS.1A6] |
| 안티-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | AB9498 | 마우스 단클론 [JC/70A] 항체 |
| 안티-CK5 | ABCAM | AB75869 | 토끼 재조합 단클론 [AY1E6] |
| 항-사이토케라틴 10 | 써모피셔 | MA5-13705 | 마우스 단클론 항체 (DE-K10) |
| 항-사이토케라틴 14 | ABCAM | AB7800 | 마우스 단클론 항체 |
| 안티-E-Cadherin | ABCAM | AB1416 | 마우스 단클론 항체 |
| 안티 필라그린 | 써모피셔 | PA5-79267 | 토끼 다클론 항체 |
| 안티-HTI-56 | 테라스 바이오테크 | TB-29AHT1-56 | 마우스 단클론 항체(IgG1) |
| 안티-HTII-280 | 테라스 바이오테크 | TB-27AHT2-280 | 마우스 단클론 항체(IgM) |
| 안티-인볼루크린 | 써모피셔 | MA5-11803 | 마우스 단클론 항체(SY5) |
| 안티 이소폼 TA p63-α, -β, -γ | 바이오렝겐트 | 618902 | 토끼 다클론 항체 |
| 안티-Ki67 | ABCAM | AB8191 | 마우스 단클론 항체 [B126.1] |
| 안티-램프3 | ABCAM | AB111090 | 토끼 다클론 항체 |
| 안티-미성숙 SP-B | 세븐 힐 | WRAB-48604 | 토끼 다클론 항체 |
| 안티-MUC5AC | 써모피셔 | PA5-34612 | 토끼 다클론 항체 |
| 항 뮤신 -2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | 마우스 단클론 항체 (IgG1) |
| 안티-p63 | 다코 | GA662 | 마우스 단클론 항체 p63 단백질(Dako Omnis) 클론 DAK-p63 |
| 안티 PCNA | 써모피셔 | PA5-32541 | 토끼 다클론 항체 |
| 안티 포도플라닌 (AT-1α) | ABCAM | AB128994 | 토끼 다클론 항체 |
| Anti-Pro + 성숙한 계면활성제 단백질 B | ABCAM | AB40876 | 토끼 다클론 항체 |
| 항-계면활성제 C | 세븐 힐 | WRAB-9337 | 토끼 다클론 항체 |
| 항자궁글로빈/SCGB1A1 | 하이컬트 바이오테크 | HM2178 | 마우스 단클론 항체 [AY1E6] |
| 안티-VE-cadherin | ABCAM | AB33168 | 토끼 다클론 항체 |
| 안티-ZO-1 | 써모피셔 | 33-9100 | 마우스 단클론 항체 [1A12] |
| 아스코르브산 | Sigma | A4544 | |
| 흡인 피펫 | 코닝 / 팔콘 | 357558 | 2 mL, 폴리스티렌, 개별 포장 |
| 흡인 팁 | - | - | 멸균(오토클레이브) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) | 써모피셔 | 37525년 | 차단제 |
| 칼슘 클로라이드 | 시그마 | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| 콜라겐 I | 어드밴스드 바이오매트릭스 | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| 콜라겐 I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (혈관 ECM) |
| 콜라겐 IV | 시그마 | C5533 | |
| 콜라겐-IV | 시그마 | C5533-5MG | 인간 태반에서 추출한 콜라겐, 5 mg 분말, 1 mg/mL로 재구성; |
| 결장 섬유아세포 | 세포 생물제제 | H6231 | |
| 결장 미세혈관 내피 세포 | 세포 생물제제 | H6203 | |
| 원뿔형 튜브 | - | - | 15 mL 및 50 mL 폴리프로필렌, 멸균 |
| 크로스링커(ER-1) | 모방 | 10461 | 5 mg 분말 |
| DAPI (4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 딜락테이트) | 써모피셔 | D3571 | DNA 프로브 |
| 피부 섬유아세포 | ATCC | PCS-201-010 | |
| 피부 미세혈관 내피 세포 | ATCC | CRL-3243 | |
| 덱사메타손 | 시그마 | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | 지브코 | ||
| DMEM/F-12, 글루타MAX | 지브코 | 10565-018 | ALI 배지용 기저 배지 |
| 당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 488) | ABCAM | AB150105 | 당나귀 안티-마우스 2차 항체 |
| 당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 568) | ABCAM | AB175472 | 당나귀 안티-마우스 2차 항체 |
| 당나귀 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 647) | ABCAM | AB150107 | 당나귀 안티-마우스 2차 항체 |
| 당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 488) | ABCAM | AB150073 | 당나귀 안티-마우스 2차 항체 |
| 당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 568) | ABCAM | AB175470 | 당나귀 안티-마우스 2차 항체 |
| 당나귀 안티 토끼 IgG H& L (알렉사 플루어 647) | ABCAM | AB150075 | 당나귀 안티-마우스 2차 항체 |
| 둘베코' s PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+ 제외) | 코닝 | 21-031-이력서 | 1배 |
| 표피 성장 인자 (EGF) 인간, 대장 | 재조합 PromoCell | C-60170 | 중간 보충제 |
| F-12 햄' s | 인비트로젠 | 21700-108 | 혈관 ECM |
| FibriCol | 고급 바이오매트릭스 | 5133-20ML | 콜라겐-I 용액 (10 mg/mL) |
| 피브로넥틴 | 코닝 | 356008 | |
| 피브로넥틴, 인간, 자연, | 코닝 | 47743-654 | 인간 혈장 피브로넥틴 |
| 세밀한 팁 정밀 핀셋 | 아벤 | 18056미국 | Technik 스타일 5B-SA 정밀 스테인리스강 핀셋 |
| 글루타맥스 | 인비트로젠 | 21700-108 | |
| 글루타맥스 | 인비트로젠 | ||
| 염소 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 594) | ABCAM | AB150080 | 염소 안티 마우스 2차 항체 |
| 염소 안티 마우스 IgG H& L (알렉사 플루어 647) | ABCAM | AB150115 | 염소 안티 마우스 2차 항체 |
| 염소 안티 마우스 IgG H& L (핏씨) | ABCAM | AB6785 | 염소 안티 마우스 2차 항체 |
| 염소 안티-마우스 IgG1 알렉사 플루어 568 | 써모피셔 | A-21124 | 염소 안티-마우스 IgG1 2차 항체 |
| 염소 안티-마우스 IgM Alexa Fluor 488 | 써모피셔 | A-21042 | 염소 안티-마우스 IgM 2차 항체 |
| 휴대용 진공 흡입기 | 코닝 | 4930년 | - |
| 열 비활성화 HyClone FetalClone II 세럼 (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| 혈구계 | - | - | - |
| 돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 소금 | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| 임상 절제 | 인간 콜로노이드 | 임상 절제에서 얻은 | |
| 인간 EGF 재조합 단백질 | 열 | PHG0311L | |
| 인간 상피 성장 인자 | 써모 | ||
| HyClone FetalClone II 세럼 (미국) | GE 헬스케어 | SH30066.02안녕 | 멸균 FBS 열 비활성화 |
| 하이드로코르티손 21-헤미숙시네이트 나트륨 염 | 시그마 | H4881 | |
| 하이드로코르티손 | 프로모션셀 | C-64420 | 중간 보충제 |
| 얼음 양동이 | - | - | - |
| 이스마텍 IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | 저속 디지털 연동 펌프; q24-채널 (12개 칩당 1개) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| 케라티노세포 성장 인자 (KGF), 또는 Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7)로도 알려져 있음, 인간, HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | 바이올라미나 | CT521-0501 | |
| 라미닌, 521 CTG (CT521) | 바이올라미나 | CT521-0501 | 인간 재조합 라미닌 521 |
| 폐 섬유아세포 | 생물학 제제 | H6013 | |
| 폐 섬유아세포 | 생명선 세포 기술 | FC-0049 | |
| 폐 미세혈관 내피 세포 | Lonza | CC-2527 | |
| 폐 평활근 세포 | 생명선 세포 기술 | FC-0046 | |
| 수동 카운터 | - | - | - |
| Masterflex(TPE) 트랜스퍼 튜빙 | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" |
| OD 중간 199, 페놀 레드 | 없음 Thermo | ||
| 마이크로 원심분리기 튜브 | - | - | 1.5 mL, 멸균 |
| 현미경 (카메라 포함) | - | - | 명시야 이미징용 |
| N2 | 시그마 | 17502001 | |
| N-아세틸 시스테인 | 시그마 | A5099 | |
| 노긴 (HEK293T 조건 미디엄) | 시그마 | N17001 | |
| 일반 염소 세럼 | 써모피셔 | 50062Z | 차단 솔루션 |
| O-포스포스릴에탄올아민 | Sigma | P0503 | |
| 파라포름알데히드(4% wt/vol) | EMS | 15710년 | 고정제 |
| 페니실린 스트렙토마이신 | GIBCO | 15140122 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마 | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| 피펫 팁 | - | - | P20, P200 및 P1000 멸균, 낮은 접착력 |
| 피펫 | 길슨 | F167380 | P20, P200 및 P1000 |
| PluriQ 세럼 교체품 (또는 대체적으로 KO 세럼 교체) | AMSBIO (또는 Thermo) | N/A (또는 C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine 코팅 현미경 유리 슬라이드 | 시그마 | P0425 | 유리 슬라이드 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| 프로게스테론 | 시그마 | P8783 | |
| ProLong Gold | 써모피셔 | P36931 | DAPI를 사용한 안티페이드 마운트앤트; |
| 레티노산 | Sigma | R2625 | |
| ROCK 억제제 (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T 조건 미디엄) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots 보충제 | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM 소기도 상피 세포 성장 매체 BulletKitTM | 론자 | CC-4124 | 중간 보충제 |
| SB2001190 | 토크리스 | 1264/10 | |
| 혈청학적 피펫 | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, 그리고 25 mL 저 내독소, 멸균; |
| 소기도 상피 세포 성장 배지 (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| 용제 완충액 (ER-2) | 모방 | 10462 | 25 mL 병 |
| 스테리플립-HV | Millipore | SE1M003M00 | 멸균 필터링 원뿔형 튜브 |
| sterilin 100 mm 스퀘어 페트리 접시 | Thermo | 103 | 멸균, 6개 당 1개 |
| T25 플라스크 | - | - | - |
| T75 플라스크 | - | - | - |
| 트리-요오드티로닌 | 시그마 | T5516 | |
| 트리톤 X-100 (0.3% (vol/vol) | 시그마 | T8787 | 투과화제 |
| 트리판 블루 | 시그마 | 93595 | 0.4% 용액 |
| TrypEE 솔루션 | 시그마 | 12604013 | 세포 분리 솔루션 |
| 트윈-20 | 시그마 | P2287 | 투과화제 |
| UV 라이트 오븐 (피크 주파수 365nm, 100 µ의 강도; J/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, 장거리 UV, 365 nm 60Hz 모델 CL-1000L |
| 진공 설정 | - | - | 최소 압력: -70 kPa |
| 혈관 내피 성장 인자 165 (VEGF-165) 인간, 대장 | 재조합 PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | 프로모션셀 | C-64420 | 중간 보충제 |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | AB8822 | 양 다클론 항체 |
| 수조(또는 구슬) | - | - | 37 °로 설정합니다. 씨 |
| Wnt3A (L-Wnt3A 조건화 매체) | ATCC | CRL-2647 |
참고문헌
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L.
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재인쇄 및 허가
