Method Article

개발중인 라이브 이미징을위한 방법 및 프로토콜

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

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논의 된 기사 :

Januschke, J., Loyer, N. 생체 이미징을 위한 피브린 응고가 있는 초파리 조직의 고정화 응용. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. 초파리의 후각 회로 조립에 대한 타임 랩스 이미징 연구를 위한 이식 시스템. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. 두개골 및 피부 제거를 통한 깨어 있는 제브라피시 유충 및 청소년의 완전히 활성화된 뇌 조직의 생체 내 이미징. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. 샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS 신경 발달 중 살아있는 세포 이미징. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. 자극 라만 산란 현미경을 사용한 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 무라벨 이미징. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, NB 제브라피시 가스트룰라에서 이광자 현미경을 사용하여 깊고 공간적으로 제어된 부피 절제. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

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발달은 소기관, 세포 및 기관 수준에서 구조의 동적 변화를 특징으로 합니다. 생리적 조건에서 동일한 구조로부터 4차원 정보를 수집하는 타임랩스 이미징의 능력은 동적 발달 과정 1,2,3,4,5,6을 연구하는 데 이상적인 기술입니다. 라이브 이미징을 통해 수집된 방대한 양의 데이터는 개발의 정량적 분석도 가능하게 합니다. 타임랩스 이미징은 단층 세포 배양에 더 널리 사용되었지만, 3차원 살아있는 조직이나 동물의 이미징은 살아있는 조직의 빛 산란, 적절한 장착 전략 및 라벨링 방법 개발, 광범위한 이미징 기간 동안 정상적인 생리적 상태 유지, 적절한 현미경에 대한 접근성, 등. 이러한 문제로 인해 많은 실험실에서 라이브 이미징의 사용이 제한됩니다. 이 방법 모음에서 7개의 논문은 라이브 샘플 준비, 라벨링 및 레이저 기반 조작의 새로운 방법을 보고했습니다. 이러한 모든 방법은 다양한 각도에서 발달 과정의 실시간 이미징을 용이하게 합니다.

심부 영역의 직접 이미징은 살아있는 조직의 강한 산란으로 인해 기술적으로 어렵습니다. 이러한 산란은 해부를 통한 내부 장기의 노출을 최소화하여 이미지의 공간 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 이 컬렉션에서 Januschke와 Loyer7 은 초파리 유충 뇌를 해부하기 위한 프로토콜과 피브린 응고를 사용한 장착 방법을 설명했습니다. 이 장착 전략은 피브리노겐과 트롬빈만 추가하면 되었기 때문에 동일한 접시에 여러 샘플의 도립 현미경을 사용하여 타임랩스 이미징을 허용했습니다. Li와 Luo8 은 파리 번데기에서 더듬이-뇌 외식편을 해부하기 위한 프로토콜과 24시간 동안 후각 회로의 정상적인 발달을 유지하는 생 체 외 배양 조건을 제시했습니다. 그들의 시스템은 생리적 상태에서 파리 후각 회로의 조립에서 축삭 및 수지상 표적화를 시각화할 수 있게 했습니다. 이 외식체 시스템은 적응 광학 기반 이미징을 갖춘 2 광자 현미경 및 격자 라이트 시트 현미경에 적합하며, 단기간에 높은 시공간 해상도로 장기 연속 이미징과 빠른 이미징을 모두 허용합니다. Schramm et al.9 은 미세 필링을 통해 제브라피쉬의 피부와 부드러운 두개골 연골을 제거하는 최소 침습 수술 절차를 개발했습니다. 이를 통해 그들은 수정 후 최대 30일까지 신경 분화, 성숙, 가소성 및 Ca2+ 일시성을 포함하여 후기 발달 단계에서 몇 가지 주요 사건을 관찰할 수 있었습니다. 또한 제브라피쉬 유충 피부의 색소 침착 후 라이브 이미징을 수행할 수 있었습니다. 해부 외에도 샘플의 적절한 장착도 라이브 이미징에 중요합니다. Ratke et al.10 은 라이트 시트 현미경을 사용하여 여러 파리 배아의 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크를 제시했습니다. 이 프로토콜은 전체 처리량을 증가시켰으며 비교 연구에 이상적입니다.

샘플 준비 외에도 새로운 라벨링 방법을 사용하면 살아있는 조직의 특정 구조를 쉽게 시각화할 수 있습니다. Terzi et al.11은 발달 중 배양된 제브라피쉬 뉴런과 전체 유충의 세포내 H2O2 수준을 이미징하기 위해 유전적으로 암호화된 H2O2 특이적 바이오센서인 roGFP2-Orp1을 보고했습니다. 이 유전적으로 암호화된 H2O2 바이오센서의 중요한 장점 중 하나는 H2O2 검출의 시간적 및 공간적 분해능이 향상되었다는 것입니다. Mutlu et al.12의 또 다른 연구에서는 세포 내 해상도로 살아있는 세포에서 지질을 빠르고 정량적으로 검출하기 위한 무표지 화학 이미징 방법인 자극 라만 산란(SRS) 현미경을 설명했습니다. H2O2 및 지질은 모두 샘플 고정 중에 쉽게 손실됩니다. 살아있는 조직에서 라벨링 또는 이미징 방법의 개발은 이러한 문제를 우회했을 뿐만 아니라 생물학적 과정에서 이러한 구조의 공간적, 시간적 정보를 유지했습니다.

마지막으로 빛은 세포 절제에도 사용할 수 있습니다. Boutillon et al.13 은 2광자 현미경을 사용하여 제브라피쉬의 깊고 공간적으로 잘 정의된 부피를 제거하는 방법을 보여주었습니다. 자외선 레이저 기반 세포 절제술과 비교하여 2광자 레이저는 축 해상도와 조직 침투력을 향상시켰습니다. 이 프로토콜은 개발 중 세포-세포 상호 작용을 연구하기 위한 섭동 전략을 제공했습니다.

미세한 기술의 발전으로 우리는 많은 발달 과정을 4차원으로 이해할 수 있게 되었습니다. 이 컬렉션의 프로토콜은 더 많은 과학자들이 다양한 생물학적 시스템에서 라이브 이미징의 기술적 장벽을 극복하는 데 도움이 될 것입니다. 앞으로 라이브 이미징을 용이하게 하는 더 많은 방법이 개발될 것으로 기대합니다.

Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 JoVE Method Collection 문제는 NIH 1K99DC01883001에서 자금을 지원했습니다. 박사 후 과정 멘토인 Liqun Luo, 공동 연구자인 Eric Betzig 및 Tian-Ming Fu에게 박사 후 과정 프로젝트 기간 동안 타임 랩스 이미징에 대한 관심을 키울 수 있도록 강력하게 지원해 주신 것에 감사드립니다. 또한 저를 채용하고 제 연구실에서 타임랩스 이미징 연구를 계속할 수 있도록 지원해 주신 Zhejiang University의 뇌 과학 및 뇌 의학 대학에 감사드립니다.

References

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