방법 논문

C. elegans를 사용하여 단백질 정체 불균형 모니터링

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DOI:

10.3791/64643

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2022년 8월 24일

 , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

이 논문에서

초록

단백질 정체 네트워크는 단백질체 기능을 보장하고 세포 및 유기체 건강을 증진하는 세포 단백질 품질 관리 시스템입니다. 나이가 들수록 충실도가 감소하여 스트레스에 대한 프로테옴의 취약성이 증가하고 결국 신경퇴행성 질환 및 암과 같은 질병에 대한 취약성이 증가합니다. 진화적으로 보존된 이 네트워크에 대한 연구를 강조하기 위해 JoVE(Journal of Visualized Experiments)는 C. elegans를 사용하여 단백질 정체 불균형을 모니터링하는 연구자들의 방법 모음을 제시합니다. 이 사설은 세포, 조직 및 유기체 수준에서 단백질 정체 네트워크를 이해하기 위한 이러한 다양한 실험적 접근 방식에 대한 간략한 개요를 제공합니다.

논의된 기사:

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하기 위한 표준화된 방법. 시각화 실험 저널. (161), 도이:10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. 외. 나노유체 기술을 사용하여 단일 및 벌크 C. elegans 샘플에서 고처리량 정량적 RT-PCR. 시각화 실험 저널. (159), 도이:10.3791/61132 (2020).

Bar-Ziv, R. 외. C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정. 시각화 실험 저널. (159), 도이:10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. 웜 정렬 및 Worm_CP, Caenorhabditis elegans에서 얻은 형광 이미지 데이터의 교정 및 정량화를 위한 두 개의 오픈 소스 파이프라인. 시각화 실험 저널. (159), 도이:10.3791/61136 (2020).

Lazaro-Pena, MI, Cornwell, AB, Samuelson, AV Caenorhabditis elegans의 조직 특이적 단백질 정지 감소 정량화. 시각화 실험 저널. (175), 도이:10.3791/61100 (2021).

Dror, S., Meidan, TD, Karady, I., Ben-Zvi, A. Caenorhabditis elegans를 사용하여 조직 특이적 샤페론 상호 작용을 스크리닝합니다. 시각화 실험 저널. (160), 도이:10.3791/61140 (2020).

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. 전신 스트레스 신호 전달을 위한 구성 요소를 식별하기 위한 조직 특이적 RNAi 도구. 시각화 실험 저널. (159), 도이:10.3791/61357 (2020).

피가치니, ML, 키르스타인, J. 광전환성 덴드라2를 사용한 노화 C. elegans의 단백질 회전율의 생체 내 정량화. 시각화 실험 저널. (160), doi:10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, ML, Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. 형광 수명 이미징을 사용한 노화 C. elegans의 아밀로이드 구조 특성화. 시각화 실험 저널. (157), doi:10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. C. elegans에서 RAN 펩타이드 독성 측정. 시각화 실험 저널. (158), doi:10.3791/61024 (2020).

Arnold, ML, Cooper, J., Grant, BD, Driscoll, M. C. elegans의 큰 외소포에서 생체 내 신경 응집체 및 소기관 압출 점수를 매기기 위한 정량적 접근법. 시각화 실험 저널. (163), doi:10.3791/61368 (2020).

사설

단백질 항상성 또는 단백질 정체는 세포 및 유기체 건강의 기본입니다 1,2. 보존된 세포 과정은 단백질 합성, 접힘 및 제거에 영향을 미쳐 적절하게 접힌 프로테옴을 유지하기 위해 협력합니다 3,4. 단백질 정체의 교란은 연령 관련 신경퇴행성 질환 및 암과 관련이 있습니다 5,6. 높은 수준의 보존을 바탕으로 선충 Caenorhabditis elegans(C. elegans)와 같은 모델 유기체는 인간의 건강과 질병에서 단백질 정체의 역할을 이해하는 데 중요한 역할을 해왔습니다 7,8. C. elegans는 짧은 수명주기, 투명한 큐티클, 화학적 및 유전적 조작의 용이성을 포함하여 이상적인 실험 모델이 되는 많은 특성을 가지고 있습니다9. 이 방법 수집은 C. elegans의 분자, 세포 및 유기체 수준에서 단백질 정체 불균형을 모니터링하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

세포는 세포 프로테옴을 재조정하기 위해 열 충격 반응(HSR), 풀린 단백질 반응(UPR) 및 산화 스트레스 반응(OxSR)을 포함한 다양한 스트레스 반응을 활성화함으로써 단백질 정체의 중단에 반응합니다10. 현장에서 재현성을 향상시키기 위해 HSR의 강력한 유도를 위한 표준화된 관행이 Golden과 동료들에 의해 설명됩니다11. RT-qPCR은 mRNA를 정량화하여 유전자 발현을 분석하는 데 널리 사용되는 민감한 방법이며, 이 분석은 다양한 열충격 유도 유전자의 세포 mRNA 수준을 측정하는 데 사용할 수 있습니다11. 이 접근 방식을 대규모의 고처리량 분석으로 확장하기 위해 Chauve et al.12는 견고하고 고감도인 나노유체 RT-qPCR 플랫폼과 결합된 cDNA 준비에 대한 새로운 적응을 설명합니다. 유전자 발현의 정확한 측정은 단일 웜 또는 벌크 샘플(12)에서 수행될 수 있습니다. 스트레스 반응 유전자의 전사 상향 조절을 측정하기 위한 프라이머 쌍과 함께 권장되는 스트레스 반응 유전자 표적은 해당 프로토콜12,13에 나열되어 있습니다.

스트레스 반응의 활성화를 평가하기 위해 RT-qPCR을 사용할 때의 한 가지 한계는 비용이 많이 들고 기술적으로 어려울 수 있으며 특수 장비를 사용해야 한다는 것입니다. 따라서, 스트레스 유도 프로모터(예를 들어, HSR 모니터링을 위한 hsp-16.2p::gfp) 하에서 형광 단백질을 발현하는 경로 특이적 전사 리포터 균주는 세포 스트레스 반응을 평가하기 위해 자주 사용된다11. Okkenhaug와 동료들은 CellProfiler 파이프라인 Worm_CP와 결합된 Worm-align이라는 간단한 오픈 소스 피지 기반 워크플로를 사용하여 개별 웜의 형광을 신속하게 정량화하기 위한14가지 단계를 설명합니다. 또한 Bar-Ziv et al.13은 수천 마리의 동물에 대한 형광 강도, 크기 및 공간(2D) 분포를 캡처할 수 있는 대입자 유세포 분석기를 사용하는 고처리량 방법을 설명합니다. 웜 바이오소터를 사용한 형광 현미경 및 정량화에 대한 권장 설정과 함께 세포 스트레스 반응의 활성화를 평가하기 위한 전사 리포터에 대한 정보가 제공됩니다13. 중요한 것은 이러한 리포터가 특정 스트레스 요법에 따른 동물의 건강을 모니터링하는 특정 생리학적 스트레스 생존 분석과 짝을 이룰 수 있다는 것입니다11,13. 형광 리포터는 조직 특이적 차이를 드러낼 수 있는 장점이 있지만 특정 임계값 이상의 유도만 검출할 수 있으며 GFP와 같은 특정 형광단의 안정성으로 인해 유전자 발현의 동적 변이가 검출되지 않습니다. 또한 대부분의 생리학적 분석은 시간이 많이 걸리므로 확장성이 제한적입니다. 이러한 한계에도 불구하고 이러한 방법을 사용하면 내부 및 외부 스트레스 요인의 세포 및 생리학적 효과를 포괄적으로 특성화할 수 있습니다.

만성 단백질독성 교란은 기능적 단백질체 유지를 담당하는 품질 관리 기계인 단백질 정체 네트워크(PN)의 붕괴와 관련이 있습니다 5,6. 단백질 정체의 점진적인 감소는 많은 연령 관련 질병과 관련이 있습니다. C. elegans는 단백질 정체 실패에 대한 특정 조직의 취약성을 조사하는 훌륭한 모델 시스템입니다. Lazaro-Pena et al.15는 벌레가 나이가 들면서 체벽 근육 또는 신경 기능을 모니터링하는 접근 방식을 설명합니다. 이 접근법은 고처리량 유전자 분석 또는 약물 스크리닝에 적용될 수 있습니다15. 주요 과제는 생체 내에서 PN의 다양한 구성 요소 간에 상호 작용이 어떻게 작동하는지 이해하는 것입니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 Dror와 동료들16은 발달 및 노화 과정에서 특정 조직에서 PN의 핵심 구성 요소인 분자 샤페론의 상호 작용에 대한 특정 정보를 수집하는 시스템을 개발했습니다. 접힘 평형의 조직 특이적 교란을 RNAi에 의한 표적 유전자의 조직 특이적 침묵을 가능하게 하는 이용 가능한 돌연변이 또는 형질전환 균주와 결합함으로써 주어진 조직의 샤페론 네트워크를 검사할 수 있습니다. 특정 조직 또는 세포 유형의 기능을 평가하는 간단한 행동 분석으로 이 전략을 보완하면 생체 내 PN의 생물학적으로 관련된 상호 작용을 밝힐 수 있습니다 15,16. 한 조직 또는 세포 유형의 단백질 정체 불균형이 세포 비자율적 방식으로 추가 조직의 품질 관리 시스템에 영향을 미칠 수 있음을 인식하는 것이 중요합니다. Miles 및 van-Oosten-Hawle17은 다양한 스트레스 리포터 및 단백질 정체 센서와 결합된 조직 특이적 RNAi 접근법을 사용하여 세포 비자율 PN의 메커니즘 및 구성 요소를 식별하는 접근 방식을 설명합니다17. 이 전략은 세포 비자율 활성화 스트레스 반응 메커니즘의 결과로 다양한 조직의 PN 용량을 검사할 수 있게 해줍니다.

C. elegans는 헌팅턴병과 같은 폴리글루타민 반복 확장 돌연변이로 인한 연령 관련 신경퇴행성 질환을 모델링하는 데 일반적으로 사용됩니다18. 많이 활용되는 단백질 정체 센서는 polyQ 길이와19세에 따라 생체 내에서 병소를 형성하는 형광 단백질에 융합된 폴리글루타민(polyQ) 단편입니다. 생물학적 시험 전체, 개인 간, 실험실 간 재현성을 개선하려면 초점으로 채점되는 항목을 정의해야 합니다. Lazaro-Pena et al.15는 노화 동안 뉴런 또는 체벽 근육 내에서 polyQ::YFP 병소 형성을 정확하게 측정하는 전략을 설명합니다. 폴리글루타민 확장을 지닌 응집 경향성 돌연변이 헌팅틴 단백질의 회전율을 모니터링하기 위해 Pigazzini와 Kirstein20은 광전환 형광단 Dendra2의 사용이 필요한 비침습적 기술을 설명합니다. 공초점 현미경과 Dendra2에 융합된 돌연변이 헌팅틴을 발현하는 C. elegans 균주를 사용하여 노화 유기체에서 응집되기 쉬운 이 단백질의 분해를 모니터링하고 정량화할 수 있습니다20. 돌연변이 헌팅틴과 같은 응집되기 쉬운 단백질의 아밀로이드 섬유화를 정량화하기 위해 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 사용할 수 있습니다21. FLIM은 아밀로이드 구조에 가까운 형광단의 소멸을 모니터링하여 응집 과정의 비침습적 분석을 가능하게 하여 형광 수명을 감소시킵니다21. 형광 수명은 융합된 아밀로이드 단백질의 응집과 음의 상관관계가 있으며 형광단 발현 수준과 무관합니다. 이 기술을 통해 연구자는 노화 및 PN 손상이 모든 단백질의 응집 성향에 미치는 영향을 추적할 수 있습니다. 그러나 형광단의 강도가 낮으면 FLIM은 상대적으로 많은 수의 광자를 획득해야 하기 때문에 문제가 될 수 있습니다. 따라서 더 높은 여기 레이저 출력이 필요하므로 광표백이 빨라지고 붕괴 곡선이 신뢰할 수 없습니다. 또한, 이 기술에는 기존 현미경 시스템에 대한 추가 기능으로 정교하고 값비싼 장비가 필요합니다. 반복 확장을 포함하는 RNA와 관련된 반복 관련 비AUG 의존성(RAN) 번역을 조사하는 다른 프로토콜에 대한 중요한 표준화된 접근 방식이 포함됩니다. RAN 번역은 판독 프레임을 결정하기 위해 시작 코돈이 필요하지 않기 때문에 가능한 질병 관련 독성 펩타이드의 수가 증가합니다. Rudich와 동료들22는 C. elegans의 이동 및 번식을 사용하여 RAN 펩타이드 독성을 정량화하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.

단백질 정체의 불균형은 단백질 잘못된 접힘과 여러 연령 관련 신경퇴행성 질환과 관련된 단백질 응집체의 축적으로 이어집니다 5,6. 형광 리포터에 융합된 다양한 응집 경향성 단백질을 발현하는 C. elegans 균주는 다양한 세포 및 조직 유형에 걸쳐 단백질 정체 불균형을 모니터링하는 데 활용되었습니다. 이러한 모델에 대한 분석은 일련의 새로운 관찰로 이어졌습니다. Monica Driscoll과 동료들은 뉴런이 "엑사이퍼"에서 PolyQ 응집체와 손상된 소기관과 같은 기타 세포 파편을 방출하여 이전에 인식되지 않았던 신경 단백질 정체 분기를 발견한다는 사실을 발견했습니다23. 이는 새로운 현상이기 때문에 현장 내 재현성을 보장하기 위해 엑소퍼 생산을 모니터링하기 위한 명확한 지침을 제공하는 것이 중요합니다. Arnold et al.24는 C. elegans 엑시퍼의 물리적 특징, 검출 전략, 식별 기준 및 정량화를 위한 최적의 시기를 간략하게 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 엑소퍼 생산에 대한 재현 가능한 평가를 달성하기 위해 엑소퍼 수준을 조절할 수 있는 의도하지 않은 응력을 제거하기 위해 성장 조건을 엄격하게 제어하는 데 필요한 중요한 주의를 강조합니다.

이 컬렉션은 C. elegans의 분자, 세포 및 유기체 수준에서 단백질 정체 불균형을 모니터링하기 위한 여러 방법론적 전략을 제공합니다. 잘못 접힌 질병 단백질과 같은 스트레스 요인은 실험적으로 특정 조직 유형에 도입될 수 있으며, 단백질 독성에 대한 세포 및 유기체 반응은 시간이 지남에 따라 모니터링됩니다. 이 컬렉션은 단백질 정체를 조사 및 모니터링하고, 접힌 단백질체를 유지하는 품질 관리 시스템을 평가하고, 질병을 유발하는 이러한 시스템의 조절 장애를 조사하기 위한 툴킷을 제공합니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 방법 수집에 매우 귀중한 기여를 해주신 동료들에게 감사드립니다.

참고문헌

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  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

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