방법 논문

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

DOI:

10.3791/64644

⸱

2023년 5월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

이 논문에서

요약

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우리는 활성화된 호중구에서 파생된 호중구 세포외 트랩 잔해의 두 가지 구성 요소인 골로페록시다제 접합 DNA 및 호중구 엘라스타제 접합 DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다.

초록

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미생물과 같은 특정 자극은 호중구가 호중구 세포외 트랩(NET)을 방출하게 하는데, 이는 기본적으로 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)와 같은 과립 단백질과 세포질 및 세포골격 단백질이 있는 DNA로 구성된 거미줄과 같은 구조입니다. 최근 NET에 대한 관심이 높아졌지만 임상 환경에서 NET을 측정하는 데 사용할 수 있는 민감하고 신뢰할 수 있는 분석 방법은 없습니다. 이 기사에서는 순환 NET의 두 가지 구성 요소인 MPO-DNA 및 NE-DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석에 대해 설명하며, 이는 NET의 특정 구성 요소이며 NET의 분해 산물로 세포외 공간으로 방출됩니다. 상기 분석은 포획 항체 및 DNA 특이적 검출 항체로서 MPO 또는 NE에 대한 특이적 단일클론 항체를 사용한다. MPO 또는 NE는 MPO-DNA 또는 NE-DNA 복합체를 함유하는 샘플의 초기 인큐베이션 동안 포획 항체의 한 부위에 결합한다. 이 분석은 우수한 선형성과 높은 분석 간 및 분석 내 정밀도를 보여줍니다. 우리는 급성 호흡 곤란 증후군을 동반하는 COVID-19 환자 16 명에게 사용했으며 MPO-DNA 및 NE-DNA의 혈장 농도가 건강한 대조군에서 얻은 혈장보다 유의하게 높다는 것을 발견했습니다. 이 검출 분석은 인간 혈장 및 배양 상청액에서 NET의 특성을 조사하기 위한 신뢰할 수 있고 매우 민감하며 유용한 방법입니다.

서론

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이 기사에서는 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 DNA 1,2와 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)의 복합체를 검출함으로써 생물학적 체액에서 호중구 세포외 트랩(NET) 형성을 정량화하는 방법을 설명합니다. NET은 호중구 과립 3,4에서 유래한 항균 프로테아제로 장식된 DNA 골격으로 구성됩니다. MPO-DNA와 NE-DNA 복합체는 모두 NET의 중요하고 특정한 구성 요소이며 NET 3,4의 분해 산물로서 세포외 공간으로 방출됩니다.

NET은 항균 방어3에서 중요한 생리학적 역할 외에도 혈전 형성6의촉진과 패혈증7의 악화를 포함하여 다양한 병리학적 효과4,5를 가지고있....

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프로토콜

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본 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 아이치 의과대학 임상시험심사위원회(2017-H341, 2019-H137)의 승인을 받았다. 각 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.

1. 시약 준비

참고: 샌드위치 ELISA 분석을 수행하기 위해 시약은 아래에 설명된 대로 준비됩니다.

  1. 코팅 버퍼:
    1. 0.1 mol/L 탄산염-중탄산염 완충액을 만들기 위해 무수 탄산나트륨 10.6g(분자량, 106g/mol)과 중탄산나트륨 8.4g(분자량, 84g/mol)의 무게를 잰다.
    2. 비커에 있는 약 900mL의 증류수에 추가합니다.
    3. 희석된 염산 또는 수산화나트륨을 필요한 양만큼 첨가하여 완충액의 pH를 9.6으로 조정합니다.
    4. pH 측정기로 pH를 확인하십시오.
    5. 그런 다음 필요한 양의 증류수를 추가하여 총 부피가 1,000mL가 되도록 합니다.
    6. 이 0.1 mol/L 탄산염-중탄산염 완충액을 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
  2. 블로킹 버퍼:
    1. 137mmol/L NaCl, 8.1mmol/L Na2HPO4, 2.68m....

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결과

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이 방법은 MPO 관련 및 NE 관련 DNA를 측정하기 위해 항-MPO, 항-NE 및 항-DNA 단클론 항체와 함께 샌드위치 ELISA를 사용했습니다(그림 1). 이 방법에서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 MPO-특이적 또는 NE-특이적 단일클론 항체로 코팅하여 DNA-연관 MPO 및 DNA-연관 NE 뿐만 아니라, 비-DNA-연관 MPO 및 NE를 포획하였다. 분석 내 가변성 계수(CV)를 계산하기 위해 COVID-19 환자와 건강한 대조군으로부터 수집한 30개의 샘플에 대해 동일한 플레이트 내에서 중복 측정을 수행했으며 %CV는 중복 측정의 평균으로 계산되었습니다. 분석 간 CV(즉, 플레이트 간 일관성)를 계산하기 위해 COVID-19 환자와 건강한 대조군의 두 가지 유형의 샘플을 10개의 다른 플레이트에서 4배로 측정했습니다. 이 분석의 특이성을 입증하기 위해, MPO 및 NE에 대한 특정 단클론 항체 대신 이소형 대조군 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 다양한 농도.......

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토론

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본 발명자들은 MPO-DNA 또는 NE-DNA 복합체를 함유하는 샘플의 초기 배양 동안 MPO 또는 NE가 포획 항체의 한 부위에 결합하는 샌드위치 ELISA 방법을 설명하였다. 세척 후, "샌드위치"는 샘플을 퍼옥시다아제-관련 항-DNA 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션함으로써 완성된다. 결합되지 않은 2차 항체를 제거한 후, 발색 ABTS 과산화효소 기질을 첨가하여 결합된 퍼옥시다제 접합체를 검출하고, 이는 405nm에서 분광광도계로 판독할 수 있는 가용성 최종 생성물을 생성합니다. 우수한 선형성과 높은 분석 간 및 분석 내 정밀도는 이 논문 및 기타 1,2에 설명된 ELISA 분석이 임상 적용에 대해 신뢰할 수 있고 실현 가능하다는 것을 나타냅니다. 또한, DNase-처리된 PMA-자극 호중구의 상청액이 NET-표준에 대한 최대 신호로서 할당될 때, 이 ELISA 분석은 반-정량적 방법으로서 사용될 수 있다 1,14,1.......

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공개 사항

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이 연구 중에 생성 및/또는 분석된 모든 데이터는 이 게시된 기사에 포함되어 있습니다. 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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저자는 원고 검토에 도움을 준 Huq Muhammad Aminul 박사에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-Step PolymorphsAccurate Chemical and Scientific CorporationAN221725인간의 혈액에서 PMN의 분리.
96웰 마이크로타이터 플레이트Thermo Fisher Scientific467466평평한
바닥 ABTS 완충 용액Sigma-Aldrich Merck11 204 530 001과붕산나트륨, 구연산 및 인산수소이나트륨을 함유하고 있습니다.
ABTS 정제Sigma-Aldrich Merck11 204 521 001 각 정제에는 5mg의 ABTS 기질과 60mg의 차량 물질이 포함되어 있습니다.
접착 플라스틱 커버, AxygenThermo Fisher Scientific14222348
Anti-MPO 항체Sigma-Aldrich Merck  07-496-I2-8°C에 보관하며 1년간 안정되어 있습니다. 숙주 종은 토끼입니다.
Anti-NE 항체, 클론 AHN-10Sigma-Aldrich MerckMABS4612-8°C에서 1년 동안 안정적입니다. 숙주 종은 마우스입니다.
소 혈청 알부민Biomedical ScienceBR-220700081소 분획 V. Store at 2&ndash의 알부민; 8 °C. 2년 동안 안정적입니다.
DNase INew England BioLabsM0303M-20 °에 저장; C
IgG, 토끼, 아이소타입 컨트롤GENETEX, Inc.GTX350352&ndash에 집중된 해결책으로 저장하십시오; 8 °C입니다.
IgG1, 마우스 Isotype Control, 클론 Ci4Merck MABC0022&ndash에 집중된 해결책으로 저장하십시오; 8 °C입니다.
리튬 헤파린 혈액 수집 튜브Becton Dickinson and Company
마이크로플레이트 믹서하나의 법인으로서NS-P
마이크로플레이트 리더분자 장치SpectraMax 190 405&ndash의 파장을 읽을 수 있는 모든 마이크로플레이트 플레이트 리더; 490nm를 사용할 수 있습니다.
마이크로플레이트 리더 애플리케이션Molecular DevicesSoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA anti-DNA, cell death Detection ELISARoche Diagnostics1154467500  병 2. 2&ndash에 저장; 8 °C. 1년 동안 안정적입니다.
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-Aldrich MerckP8139인간 혈액에서 PMN의 활성화.
인산염 완충 용액Takara BioT9181실온에서 보관하십시오. 6개월 동안 안정적입니다.
시그마플롯 v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
아지드화나트륨Fujifilm Wako Chemicals190-14901실온에서 보관하십시오.
t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, tert-옥틸페닐 에테르Fujifilm Wako Chemicals9002-93-1실온에서 보관하십시오.
은 ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B.

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재인쇄 및 허가

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MPO DNANE DNADNaseNET

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