방법 논문

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

DOI:

10.3791/64656

⸱

2022년 10월 14일

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유전자 발현의 후성유전학적 조절은 일반적으로 전사 억제 또는 활성화를 위해 각각 이색성 또는 진색소 히스톤 마크를 생성하는 히스톤 변형 효소(HME)의 영향을 받습니다. HME는 전사 인자(TF)에 의해 표적 염색질에 모집됩니다. 따라서 HME와 TF 간의 직접적인 상호 작용을 감지하고 특성화하는 것은 기능과 특이성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 이러한 연구는 생체 조직 내에서 생체 내에서 수행되는 경우 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 여기에서는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 사용하여 식물 히스톤 데비 퀴티 나제와 식물 전사 인자 사이의 식물 잎에서의 상호 작용을 시각화하기위한 프로토콜이 설명되며,이를 통해 서로 <10nm 이내에있는 단백질 분자 간의 복합체를 검출 할 수 있습니다. FRET 기술의 두 가지 변형이 제시됩니다 : SE-FRET(감작 방출) 및 AB-FRET(수용체 표백), 여기서 에너지는 공여체에서 수용체로 비방사성으로 전달되거나 수용체의 광표백시 공여체에 의해 방사적으로 방출됩니다. SE-FRET와 AB-FRET 접근법 모두 플란타의 다른 단백질 간의 다른 상호 작용을 발견하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물 히스톤 데유비퀴티나제는 히스톤의 번역 후 변형에 의해, 특히 이들의 모노유비퀴틸화 마크를 삭제함으로써 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 한다1. 지금까지 OTLD1은 애기장대 2,3에서 분자 수준에서 특징 지어지는 몇 안되는 식물 히스톤 데비 키티 나제 중 하나입니다. OTLD1은 H2B 히스톤 분자로부터 모노 유비 퀴틴 그룹을 제거하여 표적 유전자 염색질 4,5에서 H3 히스톤의 유 크로 마틱 아세틸 화 및 메틸화 변형의 제거 또는 첨가를 촉진합니다. 또한, OTLD1은 다른 염색질 변형 효소 인 히스톤 라이신 데 메틸 라제 KDM1C와 상호 작용하여 표적 유전자 6,7의 전사 억제에 영향을 미친다.

대부분의 히스톤 변형 효소는 DNA 결합 능력이 부족하여 표적 유전자를 직접 인식 할 수 없습니다. 한 가지 가능성은 이러한 효소에 결합하여 염색질 표적에 지시하는 DNA 결합 ....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에는 니코티아나 벤타미아나, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 또는 GV3101이 사용되었다.

1. FRET 벡터 구성

  1. 기증자/수용체 FRET 쌍에 대한 형광 태그를 선택합니다.
    1. pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (재료 표 참조)의 EGFP를 사용하여 공여체 벡터를 생성합니다.
    2. pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 ( 재료 표 참조)의 mRFP를 사용하여 수용체 벡터를 생성합니다.
  2. 게이트웨이 재조합 클로닝 시스템(35)과 같은 부위 특이적 재조합 클로닝 기술(34)을 사용하여 공여체/수용체 FRET 구축물을 생성한다.
    1. 관심 단백질(36 )의 코딩 서열을 증폭합니다(즉, 애기장대 OTLD1 및 LSH10)

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도 2 는 세포핵이 3개의 채널(즉, 공여자 GFP, 수용체 mRFP, 및 SE-FRET)에서 동시에 기록된 SE-FRET 실험의 전형적인 결과를 도시한다. 이러한 데이터는 의사 색상 스케일로 코딩된 SE-FRET 효율의 이미지를 생성하는 데 사용되었습니다. 이 척도에서 파란색에서 빨간색으로의 전환은 0%에서 100%까지의 단백질-단백질 근접성을 측정하는 FRET 효율의 증가에 해당합니다. 본 대표적인 실험에서 SE-FRET 신호는 세포핵에 기록되었으며, LSH10 및 OTLD1의 동시 발현 후 강도는 mRFP-GFP 발현 후 관찰된 강도(즉, 양성 대조군)와 유사하였다. 음성 대조군 (즉, OTLD1-mRFP 및 LSH4-GFP 또는 유리 mRFP 및 LSH10-GFP의 동시 발현)에서는 SE-FRET가 관찰되지 않았다.

LSH10-OTLD1 상호작용은 AB-FRET를 사용하여 정량화하였다. 이를 위해, 공여체 GFP 형광은.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 FRET 프로토콜은 간단하고 재현하기 쉽습니다. 또한 최소한의 공급 투자가 필요하며 많은 현대 실험실에 표준 장비를 사용합니다. 특히, 다섯 가지 주요 기술적 특징이이 절차의 다양성을 구별합니다. 첫째, FRET 구축물은 기존의 제한 효소 기반 클로닝에 비해 사용하기 쉽고 정확한 결과를 생성하며 시간을 절약하는 클로닝 접근 방식인 부위 특이적 재조합을 사용하여 생성됩니다. 둘째, N. benthamiana 식물은 재배가 간단하고 비교적 많은 양의 조직을 생산하며 대부분의 실험실에서 사용할 수 있습니다. 셋째, 농 침투는 전달 된 구조물의 일시적인 발현을 초래하고, 따라서 트랜스 제닉 식물을 생산하는 데 필요한 개월에 비해 상대적으로 짧은 기간 (즉, 24-36 시간) 내에 데이터를 생성합니다. 넷째, 공동 농업 침투에 의해 관심있는 구조물의 다양한 조합을 전달하는 능력은 모든 단백질 간의 상호 작용을 테스트 할 수있게합니다. 마지막으로, SE-FRET와 AB-FRET는 레이저 채널 설정 중 하나를 켜거나 끄는.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.C. 실험실에서의 작업은 NIH (R35GM144059 및 R01GM50224), NSF (MCB1913165 및 IOS1758046) 및 BARD (IS-5276-20)의 보조금으로 지원됩니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토시링곤 (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto tryptonBD Biosciences#211705
Bacto 효모 추출물BD Biosciences#212750 
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)ZeissLSM900유사한 기능을 가진 모든 CLSM이 적합합니다
EHA105VWR104013-310우리는 Citovsky 세균 실험실 재고 컬렉션의 재고를 사용합니다
Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296우리는 Citovsky 박테리아 실험실 재고 컬렉션의 재고를 사용합니다
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana 씨앗Herbalistics PtyRA4 또는 LAB우리는 Citovsky 씨앗 실험실 재고 컬렉션의 재고를 사용합니다.
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/A참조 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1해당 없음pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 구성을 기반으로 생성됨(참조 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/ApPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 구조
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
주사기 바늘 없음BD309659
Zen 소프트웨어 CLSM 이미징ZeissZEN 3.0 버전소프트웨어는 사용된 CLSM과 호환되어야 합니다.
.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes a....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Histone Modifying EnzymesTranscription FactorsProtein Protein InteractionFluorescence Resonance EnergySE FRETAB FRETPlant LeavesAgroinfiltrationConfocal MicroscopyImageJ Analysis

관련 논문