Här presenteras ett protokoll för implementering av expansionsmikroskopi i tidiga Drosophila-embryon för att uppnå superupplöst avbildning med hjälp av ett konventionellt laserskannande konfokalmikroskop.
Arbetshästen inom utvecklingsbiologi är det konfokala mikroskopet, som gör det möjligt för forskare att bestämma den tredimensionella lokaliseringen av märkta molekyler i komplexa biologiska prover. Medan traditionella konfokalmikroskop gör det möjligt att upplösa två intilliggande fluorescerande punktkällor som ligger några hundra nanometer från varandra, kräver observation av de finare detaljerna i subcellulär biologi förmågan att lösa upp signaler i storleksordningen tiotals nanometer. Många hårdvarubaserade metoder för superupplösningsmikroskopi har utvecklats för att göra det möjligt för forskare att kringgå sådana upplösningsgränser, även om dessa metoder kräver specialiserade mikroskop som inte är tillgängliga för alla forskare. En alternativ metod för att öka upplösningsförmågan är att isotropiskt förstora själva provet genom en process som kallas expansionsmikroskopi (ExM), som först beskrevs av Boyden-gruppen 2015. ExM är inte en typ av mikroskopi i sig utan är snarare en metod för att svälla ett prov samtidigt som den relativa rumsliga organisationen av dess ingående molekyler bevaras. Det expanderade provet kan sedan observeras med en effektivt ökad upplösning med hjälp av ett traditionellt konfokalmikroskop. Här beskriver vi ett protokoll för implementering av ExM i helmonterade Drosophila-embryon , som används för att undersöka lokaliseringen av Par-3, myosin II och mitokondrier i ytepitelcellerna. Detta protokoll ger en ungefär fyrfaldig ökning av provstorleken, vilket gör det möjligt att upptäcka subcellulära detaljer som inte är synliga med konventionell konfokalmikroskopi. Som bevis på principen används en anti-GFP-antikropp för att särskilja distinkta pooler av myosin-GFP mellan intilliggande cellkortiker, och fluorescerande märkt streptavidin används för att detektera endogena biotinylerade molekyler för att avslöja de fina detaljerna i den mitokondriella nätverksarkitekturen. Detta protokoll använder vanliga antikroppar och reagenser för fluorescensmärkning, och det bör vara kompatibelt med många befintliga immunofluorescensprotokoll.
Inom cell- och utvecklingsbiologi är seende att tro, och förmågan att exakt bestämma lokaliseringsmönster för proteiner är grundläggande för många typer av experiment. Konfokalmikroskopi med laserskanning är standardverktyget för avbildning av fluorescerande märkta proteiner i tre dimensioner i intakta prover. Konventionella konfokalmikroskop är oförmögna att särskilja (upplösa) intilliggande fluorescerande signaler som är separerade med mindre än hälften av våglängden för det ljus de avger1. Med andra ord måste två punktkällor separeras med minst 200-300 nm i lateral riktning (500-700 nm i axiell riktning) för att upplösa dem som två distinkta signaler. Denna tekniska barriär är känd som diffraktionsgränsen, och den är ett grundläggande hinder för studier av komplexa subcellulära strukturer (t.ex. aktomyosincytoskelett- eller mitokondrienätverk) med rumsliga egenskaper under diffraktionsgränsen. Därför är tekniker för att öka upplösningsförmågan hos konventionella konfokalmikroskop av allmänt intresse för det biologiska samhället.
För att kringgå diffraktionsgränsen har ett antal olika superupplösningsmikroskopitekniker utvecklats som möjliggör upplösning i storleksordningen tiotals nanometer eller mindre 1,2,3, vilket avslöjar en värld av biologisk komplexitet som tidigare bara var tillgänglig via elektronmikroskopi. Trots de uppenbara fördelarna med dessa hårdvarubaserade metoder har superupplösningsmikroskop ofta specifika krav på provmärkning och långa insamlingstider, vilket begränsar deras flexibilitet, eller så kan de helt enkelt vara för dyra för vissa laboratorier att komma åt. Ett alternativ till mikroskopbaserad superupplösning är expansionsmikroskopi (ExM), som inte är en typ av mikroskopi i sig utan snarare en metod för att svälla ett prov samtidigt som den relativa rumsliga organisationen av dess ingåendemolekyler bevaras. De isotropiskt expanderade proverna kan sedan observeras med en effektivt ökad upplösning med hjälp av ett traditionellt fluorescenskonfokalmikroskop. ExM beskrevs första gången av Boyden-gruppen 20155, och grundtekniken har sedan dess anpassats för användning i en mängd olika experiment 6,7,8. ExM har också anpassats för användning i helmonterade embryon, särskilt hos Drosophila 9,10,11, C. elegans12 och zebrafisk 13, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för utvecklingsbiologer.
ExM är baserad på två olika hydrogelkemier: 1) svällbara polyelektrolythydrogeler, som ökar kraftigt i storlek när de blötläggs i vatten14, och 2) polyakrylamidhydrogeler, som har extremt litet polymeravstånd för att möjliggöra isotrop provexpansion15. Även om det finns många publicerade ExM-protokoll, delar de i allmänhet följande steg: provfixering, märkning, aktivering, gelning, matsmältning och expansion4. Fixeringsvillkoren och fluorescensmärkningsstrategierna kommer naturligtvis att variera beroende på experimentets och systemets behov, och i vissa protokoll sker märkning efter expansion. Målmolekylerna i provet måste primas (aktiveras) för bindning till hydrogelen, vilket kan uppnås med hjälp av olika kemier4. Under gelningsstegen mättas provet med monomerer av den framtida hydrogelen (natriumakrylat, akrylamid och tvärbindaren bisacrylamid), och hydrogelen bildas sedan genom polymerisation av fria radikaler katalyserad av en initiator, såsom ammoniumpersulfat (APS), och en accelerator, såsom tetrametylendiamin (TEMED)4. Efter gelning smälts provet enzymatiskt för att homogenisera provets motståndskraft mot svullnad och säkerställa den isotropa expansionen av hydrogelen4. Slutligen placeras den upplösta hydrogelen i vatten, vilket gör att den expanderar till ungefär fyra gånger sin ursprungliga linjära storlek4.
Figur 1: Översikt över expansionsmikroskopi i Drosophila-embryon . ExM är ett flerstegsprotokoll som tar minst 4 dagar att slutföra. Embryoinsamling, fixering och devitellinisering tar 1 dag eller mer beroende på om embryon från flera samlingar slås samman. Immunofluorescensmärkningen tar 1 dag eller 2 dagar beroende på om embryona inkuberas över natten med de primära antikropparna. Embryoaktivering, gelning, matsmältning och expansion kan utföras på en enda dag. Gelerna kan monteras och avbildas omedelbart efter expansionen, även om det av praktiska skäl ofta är önskvärt att börja avbilda nästa dag. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Detta protokoll beskriver hur man utför ExM på helmonterade Drosophila-embryon i tidigt till mellanstadium16 för att visualisera subcellulära proteinlokaliseringsmönster med superupplösning (figur 1). Denna metod använder metylakrylsyra N-hydroxisuccinimidylester (MA-NHS) kemi för att aktivera och förankra proteinmolekyler till hydrogelen17, och det är en modifiering av ett tidigare publicerat ExM-protokoll för användning i sena stadier av Drosophila-embryon och vävnader11. Detta protokoll använder polydimetylsiloxan (PDMS) brunnar för att forma hydrogelerna och underlätta lösningsutbyte under aktivering och gelning. En alternativ metod som inte kräver att PDMS-brunnar skapas innebär att man sänker ner embryon som är fästa på täckglas i droppar av monomerlösning som sitter på en bit laboratorieförseglingsfilm22. Dessutom beskriver detta protokoll en metod för att manuellt avlägsna det ogenomträngliga vitellinmembranet som omger Drosophila-embryon , vilket är en förutsättning för immunofluorescensfärgning. Det är viktigt att notera att denna metod för handpeeling av embryon endast kan användas för att välja ut Drosophila-embryon i rätt stadiestadium före provmärkning, vilket avsevärt ökar sannolikheten för att få utökade prover av rätt stadium och orientering och därmed gör datainsamlingen nedströms mycket effektivare.
Manuell devitellinisering
De flesta Drosophila-embryofixeringsprotokoll innebär att vitellinmembranet avlägsnas genom att fasta embryon skakas i en emulsion av metanol och heptan, vilket gör att membranen spricker av via osmotisk ruptur26. Medan metanolbaserad devitellinisering (metanolpoppning) är effektiv och lämplig för många applikationer, erbjuder manuell devitellinisering (handpeeling) några betydande fördelar. För det första gör handpeeling det möjligt för en att välja exakt iscensatta embryon att devitellinisera och samla in, vilket kraftigt ökar sannolikheten för att få expanderade embryon i en användbar orientering i slutet av experimentet. Denna anrikning är avgörande när man studerar specifika aspekter av snabba utvecklingsprocesser (t.ex. mesoderminvagination eller konvergent förlängning), för vilka embryon i lämpligt stadiestadium endast kan utgöra några få procent av alla embryon, även inom ett snävt tidsbestämt insamlingsfönster. Naturligtvis, för många applikationer, kommer den mer traditionella bulkmetanolpoppningen av embryon från ett tidsbestämt insamlingsfönster att vara tillräckligt, och handpeeling kanske inte är värt den extra ansträngningen. För det andra påverkas bindningen av vissa primära antikroppar och färgämnen negativt av tidigare exponering av provet för metanol. Av denna anledning kan handpeeling ge betydande ökningar av immunfluorescenssignalkvaliteten jämfört med metanolpoppade prover, vilket gör det till en användbar allmän teknik för utvecklingsbiologer av Drosophila .
Högupplösande konfokalmikroskopi i expanderade helmonterade Drosophila-embryon
Även om det konceptuellt sett är samma sak att utföra högupplöst konfokalmikroskopi på expanderade prover som på oexpanderade prover, introducerar ExM vissa tekniska hinder. Framför allt blir embryoorienteringen, som är slumpmässig, ännu viktigare när provstorleken ökar, eftersom mål med hög förstoring och hög NA-halt endast kan fokusera ljus från provregioner som ligger mycket nära täckglaset27. Därför går det oftast bara att fokusera på de celler på eller nära embryots yta som hamnade intill täckglaset när gelen bildades. Det bästa sättet att säkerställa att det finns prover med rätt orientering i slutet är att starta ExM-protokollet med en tätt stegvis samling av fasta embryon (t.ex. genom att använda handpeeling) och att så många embryon i varje brunn (>10). För att visualisera celler djupt inne i embryots inre kan det vara nödvändigt att använda mer specialiserade avbildningsuppställningar, såsom light-sheet-mikroskopi28. Dessutom finner vi att bildkvaliteten kan förbättras genom att öppna det konfokala nålhålet till en storlek större än en luftig enhet. Naturligtvis kommer en ökad nålhålsstorlek att ske på bekostnad av minskad maximal upplösning, men i praktiken kan även små ökningar av nålhålsstorleken avsevärt öka signalintensiteten (data visas inte). Framtida studier bör systematiskt ta itu med nålhålsstorlek och effektiv upplösning i ExM-prover.
Variationer på grundläggande ExM
Protokollet som beskrivs här är ett relativt enkelt exempel på ExM som bör fungera för många applikationer och vara lätt att implementera i de flesta utvecklingsbiologiska laboratorier. Det finns dock många variationer på det grundläggande konceptet ExM 4,5,7 som kan användas för att öka signalintensiteten, uppnå ännu fler expansionsgrader och detektera nukleinsyramolekyler såväl som proteiner. I detta protokoll inkuberas embryona med antikroppar före gelning och expansion. Alternativt kan proverna behandlas med antikroppar efter att de expanderats 6,30, vilket kan öka signalintensiteten på grund av ökad epitoptillgänglighet och minskad förlust av bundna antikroppar under expansionsstegen. Dessutom kan specifika tvärbindningsmolekyler användas för att fästa RNA-molekyler på hydrogelen för att möjliggöra detektion av RNA i expanderade geler med hjälp av hybridiseringskedjereaktionsmetoden30. Slutligen kan proverna utsättas för flera expansionsrundor, som i iterativ expansionsmikroskopi (iExM)31, pan-ExM32 och expansion avslöjande (ExR)31, för att uppnå ännu högre grader av ökad upplösning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr. Jennifer Zallen för att hon har tillhandahållit marsvinets primära anti-Par-3-antikropp. Detta arbete stöddes av generös finansiering (1R15GM143729-01 och 1P20GM139768-01 5743) från National Institute of General Medical Science (NIGMS), en av medlemmarna i National Institutes of Health (NIH), samt Arkansas Biosciences Institute (ABI), som delvis finansierade inköpet av vårt konfokalmikroskop.
acrylamide | Milipore Sigma | 1490-100ML | |
ammonium persulfate | VWR | BDH9214-500G | |
anti-GFP rabbit polyclonal antibody | Torrey Pines BioLabs | TP-401 | |
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11075 | |
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
bisacrylamide | Research Products International | A11275 | |
bovine serum albumin (30% solution) | Millipore Sigma | A7284 | |
conical tubes, 50 mL | fisherscientific | 21008-940 | |
coverlip glass, square 22 mm | VWR | 48366-227 | |
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm | VWR | 48393-230 | |
glass capillaries for pulling needles | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
glass microinjection needles (pre-pulled) | World Precision Instruments | TIP10LT | |
guanidine HCl | VWR | 101970-606 | |
heptane | VWR | EM-HX0078-1 | |
latex pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester | VWR | 730300-1G | |
microfuge tube, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
multi-well plate, 6-well | Genesee | 25-100 | |
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) | Electron Microscopy Sciences | 509804487 (Fisher) | |
Pasteur pipet (2 mL, short tip) | VWR | 14673-010 | |
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) | VWR | 102092-312 | |
Petri plates | Genesee | 32-107 | |
phosphate-buffered saline (10x solution) | VWR | 97063-660 | |
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) | VWR | P8920-1ooML | |
Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | E00491 | |
scintillation vials (30 mL) | VWR | 66022-128 | |
sodium acrylate | VWR | 101181-226 | |
sodium azide (powder) | Millipore Sigma | 71289 | make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration! |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | S32354 | |
TAE (50x) | VWR | 97063-692 | |
tape (double-sided, 1 inch wide) | Scotch 3M | 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed | |
TEMED | Thermo Fisher Scientific | PI17919 | |
TEMPO | VWR | EM8.14681.0005 | catalytic oxidant |
Tween-20 | VWR | 97063-872 | extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water |
Zeiss LSM 900 | Zeiss | Laser scanning microscope used without AiryScan |