제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

요약

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

초록

표적 CRISPR-Cas 뉴클레아제 기술의 출현은 기존 모델 시스템과 새로운 모델 시스템 모두에서 정밀한 게놈 편집을 수행하는 능력에 혁명을 일으켰습니다. CRISPR-Cas 게놈 편집 시스템은 합성 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하여 CRISPR 관련(Cas) 엔도뉴클레아제를 특정 게놈 DNA 유전자좌에 표적으로 삼으며, 여기서 Cas 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 절단을 생성합니다. 본질적으로 오류가 발생하기 쉬운 메커니즘에 의한 이중 가닥 파손의 복구는 삽입 및/또는 삭제로 이어져 궤적을 방해합니다. 대안적으로, 이 공정에 이중 가닥 DNA 공여체 또는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함시키면 단일 뉴클레오티드 다형성에서 작은 면역학적 태그 또는 큰 형광 단백질 구조에 이르기까지 정확한 게놈 편집을 유도할 수 있습니다. 그러나 이 절차의 주요 병목 현상은 생식계열에서 원하는 편집을 찾아 분리하는 것일 수 있습니다. 이 프로토콜은 Danio rerio (제브라피쉬)의 특정 유전자좌에서 생식계열 돌연변이를 스크리닝하고 분리하기 위한 강력한 방법을 설명합니다. 그러나 이러한 원칙은 생체 내 정자 수집이 가능한 모든 모델에 적용할 수 있습니다.

서론

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas 시스템은 Danio rerio(제브라피쉬) 모델 시스템 1,2,3,4에서 유전자좌 특이적 돌연변이 유발 및 정확한 게놈 편집을 수행하는 강력한 도구입니다. Cas-리보핵단백질(RNP)은 Cas 엔도뉴클레아제(일반적으로 Cas9 또는 Cas12a)와 유전자좌 특이적 합성 가이드 RNA(sgRNA)의 두 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다.⁵. Cas-RNP는 함께 원하는 유전자좌에 이중 가닥 파손(DSB)을 생성하며, 이 절단은 두 가지 고유 복구 메커니즘 중 하나로 복구할 수 있습니다. NHEJ(Non-homologous End Joining) 복구 메커니즘은 오류가 발생하기 쉬우며 종종 DSB 주위에 다양한 삽입 또는 삭제(indels)가 발생합니다. 이러한 indel은 결과 단백질 서열에 프레임시프트 돌연변이 또는 조기 정지를 도입하는 경우 해로울 수 있습니다. 대안적으로, 상동성 ....

프로토콜

이 연구는 국립 보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 텍사스 대학교 오스틴 동물 관리 및 사용 위원회(AUP-2021-00254)의 승인을 받았습니다.

1. CRISPR 돌연변이 유발을 위한 sgRNA 설계

1. 표적 유전자좌를 포함하는 엑손 서열을 얻습니다.
2. Cas 엔도뉴클레아제에 특이적인 PAM(protospacer adjacent motif) 부위를 갖는 합성 가이드 RNA(sgRNA)를 설계합니다.
   1. 공여자 구조체를 공동 주입하는 경우, 가능한 한 원하는 편집에 가까운 예측 절단 부위를 갖도록 sgRNA를 설계합니다.
      참고: APE는 Cas9 sgRNA 부위를 찾을 수 있는 도구가 포함된 무료 소프트웨어입니다¹¹. 대안적으로, Cas9 및 다른 Cas 엔도뉴클레아제¹²의 상이한 PAM 부위를 고려하는 sgRNA를 설계하기 위한 온라인 인터페이스를 제공하는 CHOPCHOP과 같은 도구를....

결과

이 프로토콜에 설명된 실험적 접근 방식은 F0 주입된 남성 정자 수집에서 파생된 수천 개의 게놈 분석에 초점을 맞춰 게놈 편집 또는 추정되는 유해한 대립 유전자를 보다 신속하게 식별할 수 있도록 합니다. 그림 2 는 이 프로토콜을 사용하여 얻은 결과를 해석하는 방법을 강조합니다.

p2ry12 유전자좌에서 돌연변이를 생성하기 위해 1세포 단계 제브라피쉬 배아에 Cas9 엔도뉴클레아제와 p2ry12 특이적 sgRNA를 주입했습니다(그림 2B, 회색 강조 표시). F0 주사 된 물고기는 성적으로 성숙 할 때까지 시스템에 넣었고 6 명의 개별 수컷으로부터 정자를 채취했습니다. DNA는 고열 및 염기성 조건(HotSHOT DNA 추출)을 사용하여 정자 샘플에서 추출하고 p2ry12 유전자좌의 PCR 증폭 전에 중화시켰다. PCR 산물을.......

토론

이 프로토콜은 F0 남성 정자 게놈에 대한 집중 분석을 통해 CRISPR-Cas 기술을 사용하여 추정 게놈 편집 또는 표적 돌연변이를 신속하게 특성화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 안락사 없이 정자를 샘플링할 수 있는 다른 동물 모델에 적용할 수 있어야 합니다. 이 방법은 원하는 편집에 대한 스크리닝 처리량을 증가시키며 드문 HDR 매개 knock-in 이벤트를 식별하는 데 특히 유용합니다. 이 접근법은 또한 추정 F0 보균자로부터 하나의 정자 샘플에서 잠재적으로 수천 개의 게놈을 신속하게 스크리닝하는 것을 용이하게 함으로써 안정적인 생식계열 편집을 찾는 데 사용되는 실험 동물의 수를 줄이는 역할을 하며, 이는 추정 F0 보균자의 교차에서 파생된 수백 개의 배아를 스크리닝해야 할 수 있는 보다 전통적인 접근 방식과 대조됩니다.

이 프로토콜은 제브라피쉬 7,10,14,16,17,18의 정자 수집을 위해 확립된 프로토콜을 기반으로 하며

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스 파우더	Fisher BioReagents	BP1356-100
번식 탱크	Carolina Biological
BstNI 제한 효소	NEB	R0168S
Cas9 Endonuclease	IDT	1081060
DNA Ladder, 100 bp	써모 사이언티픽
DNAH10 기증자 구성물	시그마-알드리치	DNA 올리고; 0.025 nM, 표준 탈염 정제, dry. 5' 및 3' 말단의 처음 세 개의 인산 결합에서 공여체의 포스포로토에이트 결합 (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 포워드 프라이머	Sigma-Aldrich	DNA 올리고; 0.025 nM, 표준 탈염 정제, 건조 (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')
DNAH10 리버스 프라이머	Sigma-Aldrich	DNA 올리고; 0.025 nM, 표준 탈염 정제, 건조('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')
DNH10 합성 sgRNA	신테고	합성 sgRNA, 타겟 서열: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'
전기영동 전원 공급	장치 Thermo Scientific	105ECA-115
필터 펜치	Millipore	XX6200006P
Fish (시스템) 물	Generic	n/a
Gel 전기영동 시스템 (주조 프레임, 콤, 전기영동 챔버 포함)	써모 사이언티픽	B2
젤 이미징 라이트 박스	Azure Biosystems	AZI200-01
젤 염색, 10000X	Invitrogen	S33102
유리 그릇, 250 mL	일반	n/a
격리 탱크, 0.8 L	Aquaneering	ZT080
마이크로캡 모세관 전구, 20 &마이크로; 엘	Drummond	1-000-0020/CA
미니 원심분리기	Bio-Rad	12011919EDU
마이크로피펫, 다양한 적절한 팁	일반	N/A
전자레인지	일반	n/a
뉴클레아제 무료 물	Promega	P119-C
종이 타월	일반	n/a
PCR 튜브, 0.2 mL	Bioexpress	T-3196-1
플라스틱 스푼, 드릴 구멍/슬롯이 있음	일반	n/a
KCl 솔루션, 0.2 M RNAse Free	Sigma-Aldrich	P9333
p2ry12 포워드 프라이머	Sigma-Aldrich	DNA 올리고; 0.025 nM, 표준 탈염 정제, 건조(5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')
p2ry12 역 프라이머	튜브 내 Sigma-Aldrich	DNA 올리고; 0.025 nM, 표준 탈염 정제, 건조(5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')
p2RY12 합성 sgRNA	신테고	합성 sgRNA, 타겟 서열: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
제한 효소 10X 버퍼	NEB	B6003SVIAL
NaOH 용액, 50 mM	써모 사이언티픽	S318; 424330010
스폰지, 1인치 x 1인치 컷, 작은 타원형 디봇	일반	N/A
실체현미경	Zeiss	Stemi 508
Taq 중합효소 마스터 믹스, 2X	Promega	M7122
TBE 완충액 농축액, 10X	VWR	E442
Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
티슈 페이퍼	Fisher Scientific	06-666
트리카인-메탄설포네이트 용액(Syncaine, MS-222), 어수 0.016%(pH 7.0± 0.2)	Syndel	200-266
트리스 베이스, 1M(HCl에서 ph 8.0으로 버퍼링)	프로메가	H5131

161937FERSM0241튜브 내 튜브 내 튜브 내 튜브 내