스텐토르 코에룰리우스에서 습관화 공부하기

학습은 일반적으로 복잡한 신경계와 관련이 있지만 단일 세포에 이르기까지 모든 수준의 생명체가 지능적인 행동을 보일 수 있다는 증거가 증가하고 있습니다. 자연 시스템과 인공 시스템 모두에서 학습은 새로운 정보¹를 기반으로 한 시스템 매개 변수의 적응 형 업데이트이며, 지능은 학습을 용이하게하는 계산 프로세스의 척도입니다².

Stentor coeruleus는 반복적 인 자극 3에 따라 행동 반응이 감소하는 학습의 한 형태 인 습관화를 나타내는 단세포 연못 거주 유기체^입니다. 스텐터는 기계적 자극3에 반응하여 수축^{하는데, 이는} 수생 포식자의 명백한 탈출 반응입니다. 그러나, 반복적 인 낮은 힘 섭동은 수축 확률³의 점진적인 감소에 의해 입증 된 습관화를 유도한다. 습관화된 스텐터는 고강도 기계적 자극⁴ 또는 광 자극⁵을 받은 후에도 여전히 수축합니다. ^{동물의 습관}화에 대한 Thompson과 Spencer의 고전적인 기준과 일치하는 이러한 관찰6은 원래의 수축 반응 감소가 피로나 ATP 고갈보다는 학습으로 인한 것임을 강력하게 시사합니다. 자유 생활 세포로서 스텐터는 다세포 조직의 경우처럼 주변 세포의 간섭 없이 연구할 수 있습니다. Stentor는 큰 크기(1mm), 정량화 가능한 습관화 반응³, 주입 및 미세 조작의 용이성7, 완전히 시퀀싱된 게놈^{8, RNA} 간섭(RNAi^{) 도구의 가용성}9 등 학습을 연구하기 쉬운 몇 가지 추가 기능을 가지고 있습니다. 이 모델 유기체를 사용하여 뇌나 신경계 없이 세포 학습을 탐색하려면 Stentor 세포를 자극하고 반응을 측정하기 위한 재현 가능한 절차가 필요합니다.

여기에서는 장치를 구축하고 외부 섭동을 최소화하는 방식으로 실험을 설정하는 방법을 포함하여 지정된 힘과 주파수로 기계적 펄스를 전달할 수 있는 마이크로 컨트롤러 기판 연결 장치를 사용하여 스텐터 습관화를 정량화하는 방법을 소개합니다(그림 1). 단일 세포 수준에서 습관화를 이해하면 복잡한 회로와 독립적 인 학습 패러다임을 특성화하는 데 도움이됩니다.

그림 1: 습관화 실험 설정. 스텐터 가 들어있는 페트리 플레이트는 습관화 장치의 유연한 금속 눈금자 위에 놓입니다. 그런 다음 습관화 장치의 뼈대가 지정된 힘과 주파수로 금속 자를 쳐서 세포장을 가로질러 자극파를 생성합니다. USB 현미경 카메라는 자극에 대한 스텐터 의 반응을 기록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 습관화 실험 워크플로 요약. 그림은 습관화 장치를 사용하여 Stentor 를 연구하는 것과 관련된 기본 단계를 보여줍니다. 그림은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. BioRender.com(2022)의 "프로세스 순서도"에서 발췌. https://app.biorender.com/biorender-templates 에서 검색 함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

참고: 습관화 실험 워크플로의 요약은 그림 2에 나와 있습니다.

1. 습관화 장치 조립

1. 모터 드라이버를 모터에 연결합니다( 그림 3 참조).
   1. 드라이버 보드에서 A라고 표시된 두 개의 와이어를 모터의 파란색 및 빨간색 와이어에 연결합니다. 드라이버 보드에서 B라고 표시된 두 개의 와이어를 모터의 녹색 및 검은색 와이어에 연결합니다.
      알림: 상단에 모터 와이어가 있는 상태에서 위에서 드라이버 보드를 내려다보면 4개의 입력 와이어가 파란색, 빨간색, 검은색 및 녹색 순서로 모터 리드에 연결되어야 합니다.
2. 그림 4에 표시된 브레드 기판 회로를 구축하고 LED를 올바른 극성으로 연결하기 위해 특별히 주의하십시오.
3. 드라이버 보드의 Vcc(+5V)를 흰색 브레드 보드의 상단 레일에 연결하고 드라이버 보드의 Gnd를 브레드 보드의 하단 레일에 연결합니다.
4. 브레드 기판의 접지를 마이크로 컨트롤러 기판의 접지 핀에 연결합니다. 녹색 LED, 빨간색 LED, 스위치 및 버튼 와이어를 각각 마이크로 컨트롤러 보드 디지털 핀 8, 9, 10 및 11에 연결합니다.
5. 마이크로 컨트롤러 보드 디지털 핀 2와 3을 드라이버 보드 와이어 Step 및 Dir에 연결합니다.
6. 마이크로 컨트롤러 보드 디지털 핀 4, 5, 6 및 7을 드라이버 보드 와이어에 연결합니다.
   1. 핀 4를 MS1에 연결하고, 핀 5를 MS2에 연결하고, 핀 6을 MS3에 연결하고, 핀 7을 활성화에 연결합니다.
7. 12V 전원 공급 장치로 드라이버 보드에 전원을 공급합니다. 12V 공급 장치를 두 개의 빨간색 와이어로 모터 드라이버 보드에 연결된 검은색/녹색 어댑터 플러그에 꽂습니다.
   노트: 12V 공급 장치를 마이크로 컨트롤러 보드 플러그에 연결하지 마십시오.
8. 제어 프로그램(https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino)을 마이크로 컨트롤러 보드에 다운로드합니다.
9. USB 케이블을 사용하여 마이크로 컨트롤러 보드를 컴퓨터에 연결하면 마이크로 컨트롤러 보드의 전원으로도 사용됩니다.
10. 사용자 정의 컨트롤이 작동하는지 확인합니다.
    1. 슬라이드 스위치가 자동 모드를 켜고 끄는지 확인합니다. 자동 모드에서 시스템은 사용자가 지정한 일정한 간격으로 단계를 수행합니다(아래 참조).
    2. 자동 모드가 켜져 있을 때 녹색 LED가 켜지는지 확인합니다.
    3. 모터가 펄스를 인가하기 1초 전에 빨간색 LED가 깜박이는지 확인하십시오. 빨간색 LED는 시스템이 기계적 펄스를 전달하려고 할 때를 나타내는 경고등입니다.
    4. 시스템이 자동 모드인지 여부에 관계없이 버튼을 누를 때마다 1/16 마이크로 스텝을 트리거하는 빨간색 버튼을 테스트합니다.

그림 3: 습관화 장치의 구성 요소. 기계를 조립하려면 라벨이 붙은 모든 전자 장치가 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 전자 회로도 이것은 브레드 보드의 회로입니다. 마이크로 컨트롤러 보드에 연결되는 전선은 프로토콜에 설명된 대로 번호가 매겨집니다. D1 및 D2는 각각 적색 및 녹색 LED이며 330 Ω 저항을 통해 접지에 연결됩니다. 두 스위치는 10KΩ 저항으로 풀업됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 습관화 실험 설정

1. 스텐터를 구하십시오.
2. 35mm 플레이트를 0.01% 폴리오르니틴 용액으로 코팅합니다.
   1. 0.01% 폴리오르니틴 용액 3mL를 플레이트에 넣고 밤새 방치합니다.
   2. 초순수로 접시를 두 번, 저온 살균 샘물(PSW)로 한 번 씻습니다(재료 표).
3. 35mm 플레이트에 3.5mL의 PSW를 추가합니다.
4. 스텐터를 6 웰 플레이트 (재료 표)에서 씻으십시오.
   1. 첫 번째 웰에 3mL의 PSW를 추가하고 두 번째 및 세 번째 웰에 5mL의 PSW를 추가합니다. P1,000 피펫을 사용하여 배양 접시에서 6웰 플레이트의 첫 번째 웰에 스텐 터 2mL를 추가합니다.
   2. 실체 현미경(재료 표)으로 개별 스텐터를 식별한 다음 P20 피펫을 사용하여 첫 번째 웰에서 두 번째 웰로 스텐터 100개를 옮깁니다.
   3. 실체 현미경으로 개별 스텐터를 식별한 다음 P20 피펫을 사용하여 두 번째 웰에서 세 번째 웰로 스텐 터 100개를 옮깁니다.
5. P200 피펫을 사용하여 6웰 플레이트의 세 번째 웰에서 35mm 플레이트로 총 부피 500μL의 스텐 터 100개를 옮겨 35mm 플레이트의 최종 부피가 4mL가 되도록 합니다.
6. 습관화 장치의 금속 눈금자에 흰 종이 조각 (7cm x 7cm)을 테이프로 붙입니다. 용지의 왼쪽 가장자리가 뼈대에 가장 가까운 눈금자 끝에서 2cm 떨어져 있는지 확인하십시오.
7. 양면 테이프를 사용하여 35mm 플레이트의 바닥을 습관화 장치의 자 위에 있는 2인치 x 2인치 용지 중앙에 부착합니다.
8. 뚜껑을 닫은 상태에서 습관화 장치의 35mm 플레이트를 최소 2시간(밤새도록 연장할 수 있음) 동안 그대로 두십시오. 이 순응 기간 동안 플레이트를 실험 조명 조건과 일치하는 주변 조명 조건에 보관하십시오(즉, 셀에 명암/어두운 변동을 일으키지 않음). 또한 플레이트가 우발적인 충돌로 인한 기계적 섭동을 경험하지 않도록 하십시오.
9. USB 현미경 카메라(재료 표)를 스텐터의 35mm 플레이트 바로 위에 놓습니다. 필요한 경우 USB(범용 직렬 버스) 현미경 카메라 아래에 피펫 팁 상자와 같은 소품을 놓아 높이를 조정합니다. 또는 링 스탠드를 사용하여 높이를 조정할 수 있습니다.
10. 웹캠 레코더 응용 프로그램을 랩톱 (재료 표)에 설치하고 현미경 입력을 통해 세포를 시각화하는 데 사용합니다.
    1. 웹캠 레코더 앱을 열고 드롭다운 메뉴에서 USB 현미경을 선택합니다. USB 현미경 카메라의 초점을 조정하여 세포가 명확하게 보이도록 합니다.
    2. USB 현미경 카메라의 위치를 조정하여 시야의 셀 수를 최대화합니다.
11. 마이크로 컨트롤러 보드 직렬 모니터 열기: 라인 끝 없음을 선택하고 9,600보드로 설정합니다.
12. 마이크로 컨트롤러 보드 프로그램에서 l 명령을 사용하여 뼈대가 자에 거의 닿지 않을 때까지 전기자를 내립니다. 정확한 위치를 조정하기 위해 필요한 경우 r 명령을 사용하여 암을 올립니다.
    알림: 뼈대가 눈금자에서 상당한 거리에있는 경우 d 명령을 입력하여 모터 코일 전류를 비활성화하여 암을 눈금자쪽으로 수동으로 이동할 수 있도록합니다. 암을 수동으로 이동한 후 e 명령을 사용하여 모터 코일 전류를 활성화하고 암을 제자리에 고정합니다. 실험 시작 전에 적절하게 낮추면 뼈대의 하단 끝이 눈금자의 왼쪽 가장자리에서 1cm 떨어져 있어야합니다. 뼈대는 눈금자를 쳐서 기계적 펄스를 전달합니다.
13. i 명령을 사용하여 습관화 장치에서 자동 모드를 초기화합니다.
14. 명령줄에 단계 크기를 입력합니다. 수준 5는 가장 작은 단계이고 수준 1은 가장 큰 단계입니다. 수준 4는 기준 습관화 실험에 사용되는 단계 크기입니다.
    알림: 레벨 5 자극은 눈금자의 하향 변위를 ~0.5mm 증가시킵니다. 레벨 4는 ~1mm의 하향 변위를 초래합니다. 레벨 3은 ~2mm의 하향 변위를 초래합니다. 레벨 2는 ~3-4mm의 하향 변위를 초래합니다. 레벨 1은 ~8mm의 하향 변위를 초래합니다. 레벨 5 자극은 ~0.122N의 통치자에 대한 전기자의 하향 피크 힘을 초래합니다. 레벨 4는 ~0.288N의 하향 피크 힘을 초래합니다. 레벨 3은 ~0.557N의 하향 피크 힘을 초래합니다. 레벨 1과 레벨 2에 의해 생성 된 하향 힘은 전기자가 접촉 한 후에 발생하는 중요한 눈금자 진동으로 인해 동력계로 경험적으로 정량화하기가 더 어렵습니다.
15. 펄스 사이의 시간을 분 단위로 입력합니다. 기준 습관화 실험에 사용되는 간격은 1분입니다.
16. 빨간색 녹화 버튼을 눌러 웹캠 레코더 앱을 사용하여 비디오 촬영을 시작합니다. 그런 다음 습관화 장치의 스위치를 뒤집어 첫 번째 자동 기계적 펄스 전달로 실험을 시작합니다.

3. 실험 비디오 분석

1. 비디오에 첫 번째 기계식 펄스가 나타나기 직전에 일시 중지하고 35mm 플레이트의 바닥에 고정되고 길쭉한 트럼펫 모양으로 확장된 스텐터 의 수를 계산합니다(그림 5A, 비디오 1).
2. 첫 번째 펄스 직후, 플레이트 바닥에 고정되고 공 모양으로 수축된 스텐터 의 수를 계산합니다(그림 5B, 비디오 1).
   참고:^{수축 세포는} 수축 이벤트 동안 Stentor가 10ms 이내에 신체 길이를 50% 이상 단축하기 때문에 길쭉한 세포에서 쉽게 식별할 수 있습니다3.
3. 두 번째 카운트를 첫 번째 카운트로 나누어 기계적 자극에 반응하여 수축한 스텐터 의 비율을 결정합니다.
4. 실험 비디오의 모든 기계적 펄스에 대해 3.1-3.3단계를 반복합니다.

그림 5: 기계적 자극을 받은 후 수축하는 스텐터. (A) 스텐터는 길쭉한 상태에 있으며 페트리 플레이트의 바닥에 고정되어 있습니다. (B) 스텐터는 습관화 장치로부터 레벨 4 기계적 자극을받은 후 수축했습니다. 이미지는 USB 현미경으로 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: 스텐터 계약 비디오. 스텐터는 매분 습관화 장치로부터 레벨 4 기계적 자극을 받습니다. 이 세포는 아직 습관화되지 않았으므로 맥박을받은 후 수축합니다. 세포는 습관화 장치 위에 놓인 페트리 플레이트에 있습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

위에서 설명한 방법은 1 탭 / 분의 주파수에서 레벨 4 기계식 펄스를 사용하여 스텐터 의 수축 확률을 1 시간 이내에 점진적으로 감소시켜야합니다. 이것은 습관화를 나타냅니다( 그림 6, 비디오 2 참조).

그림 6: 기본 습관화. 스텐터 의 수축 확률은 1 탭 / 분 (n = 22-27)의 주파수에서 레벨 4 기계적 펄스를받은 후 1 시간 동안 점진적으로 감소합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2. 습관화 된 스텐터의 비디오. 세포는 1 탭 / 분의 주파수에서 동일한 힘의 기계적 펄스를받은 후 1 시간 후에 레벨 4 기계적 자극을받습니다. 대부분의 세포는 한 시간 동안 자극에 익숙해 져서 수축하지 않습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

기계적 펄스 전달의 힘 및/또는 주파수를 변경하면 스텐터 습관화 역학이 변경될 수 있습니다. 예를 들어, 1 탭 / 분의 주파수에서 레벨 2 펄스를 사용하면 1 시간 동안 습관화가 방지됩니다 ( 그림 7 참조). 레벨 5 펄스는 몇 개에서 0 개의 스텐터에서 수축을 이끌어 내야합니다.

그림 7: 더 강한 힘에 대해 1시간 이내에 습관화 부족. 스텐터 의 수축 확률은 1 탭 / 분 (n = 7-33)의 주파수에서 레벨 2 기계적 펄스를받은 후 1 시간 동안 눈에 띄게 감소하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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