열충격 단백질 90 억제제 발견을 위한 말라카이트 그린 분석

요약

말라카이트 그린 분석 프로토콜은 열충격 단백질 90(Hsp90) 억제 인자 및 ATP 의존성 효소에 대한 기타 억제제 화합물을 발견하는 간단하고 비용 효율적인 방법입니다.

초록

열충격 단백질 90(Hsp90)은 여러 발암성 단백질에 대한 샤페로닝 효과로 인해 유망한 항암 표적입니다. Hsp90의 활성은 아데노신 삼인산(ATP)을 아데노신 이인산(ADP) 및 유리 인산염으로 가수분해하는 능력에 따라 다릅니다. Hsp90의 ATPase 활성은 보호자 기능과 관련이 있습니다. ATP는 Hsp90의 N-말단 도메인에 결합하고, 그 결합을 방해하는 것이 Hsp90 기능을 억제하는 가장 성공적인 전략인 것으로 밝혀졌습니다. ATPase 활성은 ATP 가수 분해에 의해 형성된 유리 인산염의 양을 결정하는 비색 말라카이트 그린 분석에 의해 측정 될 수있다. 여기서, 말라카이트 그린 포스페이트 분석 키트를 사용하여 효모 Hsp90의 ATPase 활성을 결정하는 절차가 설명된다. 또한, 겔다나마이신을 진정한 억제제로 복용하여 Hsp90 억제제를 발견하기 위한 자세한 지침이 제공됩니다. 마지막으로, 효모 Hsp90에 대한 억제제 분자의 고처리량 스크리닝(HTS)을 통한 이 분석 프로토콜의 적용에 대해 논의합니다.

서론

열충격 단백질 90(Hsp90)은 암의 발병 및 진행을 담당하는 단백질의 안정성을 유지하는 분자 샤페론입니다. 또한, 항종양제에 대한 내성 발달을 담당하는 단백질도 Hsp90의 고객이다¹. Hsp90은 전체 단백질의 2% 미만을 구성할 수 있는 정상 세포와 비교하여 모든 암세포 유형(세포 단백질의 >90%)에서 유비쿼터스로 과발현됩니다. 더욱이, 암세포의 Hsp90은 공동 샤페론과 복합체에 존재하는 반면, 정상 세포에서는 주로 자유롭고 복합체가 없는 상태로 존재합니다 ^2,3. 최근 몇 년 동안, 몇몇 Hsp90 억제제는 시험관 내 및 생체 내 연구에서 세놀리틱 효과를 갖는 것으로 입증되었으며, 여기서 마우스의 수명을 크게 향상시켰습니다 ^4,5,6. 앞서 언급한 모든 발견은 Hsp90 억제제가 부작용이 적고 내성 발생 가능성이 감소하면서 여러 암 유형에 효과적일 수 있다는 사실을 입증합니다. Hsp90의 샤페로닝 기능은 Hsp90의 N-말단 도메인에서....

프로토콜

1. 실험실 규모의 말라카이트 그린 분석

1. 분석 완충액의 제조
   1. 표 1에 제시된 조성 및 제제에 따라 분석 완충액을 준비한다.
2. 인산염 표준물질의 제조
   1. 말라카이트 그린 분석 포스페이트 분석 키트(4°C에서 보관)에 제공된 1 mM 포스페이트 표준물을 사용한다.
   2. 960 μL의 초순수에 40 μL의 1 mM 인산염 표준물질을 피펫으로 피펫하여 40 μM 인산염 용액(premix solution)을 얻었다. 제조업체의 지침에 따라 초순수로 프리믹스 용액을 첨가하여 0에서 40 μM까지 인산염의 연속 희석액을 형성합니다.
3. 효모 Hsp90의 제조
   1. 글리세롤 스톡 농도가 0.66mg/mL인 효모 Hsp90을 사용하십시오. 사용 직전에 얼음에 해동하십시오.
   2. 측정 가능한 ATPase 활성을 위해 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM)의 효모 Hsp90을 사용하십시오. 블랭크와 양성 대조군 사이의 말라카이트 그린 시약 첨가 후 광학 밀도 차이가 0.5 이상 1.0 미만인지 확인하십시오. 여기서, 블랭크(Hsp90 없음)와 양성대조군(Hsp90 포함)의 흡광도 차이는 0.510으로 ....

결과

분석의 결과는 유리 인산 이온 농도에 의한 흡광도 측면에서 해석됩니다. 620 nm에서 효모 Hsp90에 의한 ATP 가수 분해로 인한 유리 인산염에 의한 흡광도는 100 % ATPase 활성 또는 0 % 단백질 억제로 간주됩니다. 단백질의 억제는 ATP 가수 분해 (유리 인산염 감소)의 중단으로 이어진다. 이는 620nm에서 감소된 흡광도 측면에서 반영됩니다.

실험실 규모의 말라카이트 그린 분석 결과
인산염 표준물질에 대한 표준물질 그래프는 도 3에 묘사되어 있다. Hsp90의 활성은 ATP를 ADP 및 무기 인산염 (Pi)으로 가수 분해하는 능력으로 측정됩니다. 유리 인산염 농도가 높을수록 말라카이트 그린과의 복합체 형성이 증가하여 620nm에서 감지할 수 있는 강렬한 녹색이 생성됩니다(그림 4).

토론

Hsp90은 새로운 항암제 분자 발견의 중요한 표적입니다. 1994 년에 약물 성이 확립 된 이래¹⁰, 18 개의 분자가 임상 시험에 도달했습니다. 현재 7 개의 분자가 단독으로 또는²² 개의 조합으로 다양한 임상 시험 단계에 있습니다. 이러한 모든 소분자는 N-말단 ATP 결합 억제제입니다. 샤페론을 억제하는 다른 수단(C-말단 억제제, 중간 도메인 억제제)은 N-말단 억제제만큼 빠르게 진행되지 않았습니다. 따라서 N-말단 ATP 결합 억제제 화합물은 여전히 임상적으로 시장성이 있는 분자로의 진행을 약속합니다. 또한 2022년 6월에 승인된 유일한 Hsp90 억제제(일본 GIST 치료용 Pimitespib)는 N-말단 ATP 결합 분자⁹입니다. 그러나 현재까지 단일 분자는 세계의 다른 지역에서 시장성있는 단계에 도달하지 못했습니다^23,24.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
물 속의 1M 염화 마그네슘 용액	Sigma-Aldrich	63069-100ml
물 중 1M 염화 칼륨 용액	Sigma-Aldrich	60142-100ml
96-well plate	SPL Life Sciences	해당
아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물	Sigma-Aldrich	A7699-5G
Biomek FX 연구소 자동화 워크스테이션	Beckman Coulter	해당 없음
화합물 3-96	해당 없음	없음	히스티딘 태그 효모 Hsp90은 영국 서식스 대학교 생명과학부 Chrisostomos Prodromou 박사로부터 얻었고, 단백질은 KIST 강릉 천연물연구소에서 발현하였다. 특허 침해 문제로 인해 자세한 내용을 공개할 수 없습니다.
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치	D8418
겔다나마이신, 99%(HPLC), 분말	AK Scientific, Inc.	V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free 증류수	ThermoFisher Scientific	10977015
말라카이트 그린 인산염 분석  분석 키트	Sigma-Aldrich	MAK307-1KT
다중 검출 마이크로플레이트 리더 Synergy HT	Biotek Instruments, Inc.	해당 사항
Synergy HT 다중 플레이트 리더	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4	Sigma-Aldrich	93313-1L
Yeast Hsp90	Not	applicable	영국 University of Sussex의 생명과학대학 및 단백질은 KIST 강릉 천연물연구소에서 발현되었다. 기본 식별 번호: P02829

없음 해당 없음 해당되지 않음