Method Article

Construction, characterization, and reenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates (자가 조립 인간 중간엽 줄기 세포 응집체의 구축, 특성화 및 재생 응용)

DOI:

10.3791/64697

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, The Fourth Military Medical University, 2Department of Preventive Dentistry, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3College of Life Science, Northwest University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 인간 중간엽 줄기세포의 자가조립을 기반으로 응집체를 구성하는 방법을 설명하고, 두개골 결손의 재생치료를 위한 형태학적, 조직학적 특성을 규명한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽줄기세포(MSC)는 자기재생 능력과 다계통 분화 가능성을 특징으로 하며 다양한 출처에서 유래할 수 있으며 특히 치아, 뼈, 연골 및 피부의 재생을 위한 재생 의학의 유망한 후보로 부상하고 있습니다. 특히 발달 중인 중간엽 축합을 모방한 세포 클러스터를 구축하는 MSC 응집의 자체 조립 접근 방식은 미세환경 틈새로서 보존된 세포-세포 상호 작용 및 세포외 기질(ECM)과 함께 고밀도 줄기세포 전달을 가능하게 합니다. 이 방법은 효율적인 세포 생착 및 생존을 가능하게 하여 조직 공학에서 외인성 MSC의 최적화된 적용을 촉진하고 임상 장기 재생을 보호하는 것으로 나타났습니다. 이 논문은 탯줄 중간엽 줄기세포(UCMSC)를 기반으로 하는 자가 조립 응집체의 구성 및 특성화를 위한 자세한 프로토콜과 두개골 재생 응용 사례의 예를 제공합니다. 이 절차의 구현은 조직 공학 및 재생 의학을 위한 효율적인 MSC 이식 전략을 수립하는 데 도움이 될 것입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

중간엽 줄기세포(MSC) 응축은 초기 기관 형성 1,2, 특히 뼈, 연골, 치아 및 피부 형성에서 신체의 정상적인 성장과 발달을 보장하는 데 필수적인 단계입니다 1,3,4. 지난 수십 년 동안 생분해성 골격과 결합된 배양된 산후 MSC를 사용하는 조직 공학 요법은 골형성5 및 연골 재생6에서 중요한 진전을 이루었습니다. 그러나 골격을 사용하면 면역 거부 반응, 낮은 세포 친화도 및 가소성과 같은 몇 가지 단점이 있을 수 있습니다7. 이와 관련하여, MSC와 증착된 세포외 기질(ECM)8만 포함하는 전개 현상을 모방한 스캐폴드가 없는 자체 조립 응집체를 제공하기 위해 스페로이드 세포 배양 방법을 적용하는 타당성을 조사했습니다. 응집체의 형성은 결함 모양과 일치하도록 적용 가소성을 증가시키고 이식을....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 모든 동물 절차는 제4 군사 의과 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 가이드에 따라 수행되었습니다. 상업적 공급원에서 얻은 냉동 보존된 인간 UCMSC가 본 연구에 사용되었습니다( 재료 표 참조). 인간 세포의 사용은 제 4 군사 의과 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. UCMSC는 절차를 설명하기 위한 예로 사용되었습니다. 두개골 결손은 이식 절차를 설명하기 위해 수리의 필요성을 보여주는 예로 사용되었습니다. 모든 실험은 세 번 반복되었습니다.

1. UCMSC 골재의 건설

  1. UCMSC의 준비 및 배양
    1. 10mL의 예열된 인산염 완충 식염수(PBS)를 멸균 생물 안전 작업대의 새로운 15mL 원심 튜브에 추가합니다.
    2. 액체 질소에서 얼어붙은 UCMSC가 들어 있는 동결 튜브를 제거하고 37°C 수조에 빠르게 넣습니다. 세포가 빠르고 철저하게 해동될 수 있도록 튜브를 부드럽게 흔듭니다.
      주의 : 동결 용액의 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 세포 독성을 유발할 수 있으므로 전체 절차는 1분 이내....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실험 워크플로우에 따라 UCMSC에서 응집체를 성공적으로 구성할 수 있습니다(그림 1). 응집체의 품질은 형태학적 관찰 및 조직학적 분석을 통해 사용하기 전에 평가해야 합니다. 형성된 얇은 판 구조는 완전하고 조밀해야 하며, 세포가 서로 얽혀 현미경 관찰에 의해 직조된 패턴을 형성해야 합니다(그림 2A). 엣지 컬링은 집계 중에 발견할 수 있습니다. 과도하게 말린 가장자리는 세포 갭을 남기는 성공적인 응집을 나타냅니다(그림 2B). 최종 골재는 육안 검사로 볼 수 있으며 쉽게 분리할 수 있습니다(그림 2C). 응집체는 살아있는/죽은 염색제를 사용하여 실시간으로 관찰할 수 있습니다(그림 2D). 살아있는 세포의 세포질은 calcein AM에 의해 염색.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

조직 공학 생명 공학의 발전으로 가소성이 높고 최적의 재생을 달성할 수 있는 장기 생존 세포를 포함하는 이식 가능한 구조를 구성하는 전략이 많은 과학자들의 초점이 되었습니다. 현재 MSC의 이식 방법은 세포 단독 방법, 사이토카인으로 보완된 골격 6,24 또는 줄기세포와 골격의 조합5과 같은 다양한 방법이 있습니다. 본 논문은 특정 배지에 의해 유도된 응축된 클러스터를 형성하기 위해 세포 자체 조립을 포함하는 MSC 응집체 구축 및 주입의 효율적인 방법을 제시하며, 수확 및 적용이 편리한 풍부한 세포 ECM의 장점을 제시합니다. 증착된 ECM은 숙주와 이식된 응집체 사이의 생체 분자 교환을 향상시키는 천연 골격 역할을 하여 MSC25,26

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가자연과학재단(81930025, 82100969, 82071075)과 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2022YFA1104400 및 2021YFA1100600)의 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 기초 의학을 위한 국립 실험 교육 시범 센터(AMFU)의 도움에 감사드립니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)SigmaT4049Cell passage
Automatic Dehydration MachineLEICAASP200sDehydrate aggregate
CentrifugeEppendorf5418RCentrifugation
Centrifuge tubeThermo Nunc339650Centrifugation
Culture dishThermo150466Culture of UCMSCs
에탄올SCR10009218탈수 골재
치명적 소 혈청Sijiqing11011-8611UCMSCs
겸배양 JZJD1080수확 골재
글루타르알데히드Proandy10217-1골재
Hematoxylin 및 Eosin 염색 키트고정 beyotimeC0105SHE 염색
HexamethyldisilazaneSCR80068416건조 골재 표면
Hoechst33342Sigma14533세포핵 염색
L-글루타민SigmaG5792UCMSCs
배양 생존력/세포독성 키트 InvitrogenL3224Live/dead cell stain
Masson's Staining KitZHCCD069Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTCulture of UCMSCs
ParaffinLeica39601006Tissue embedding
ParaformaldehydeSaint-BioD16013골재 고정
PBS (1x)MeilunbioMA0015UCMSCs
페니실린 / 스트렙토 마이신프로셀 생명 과학PB180120UCMSCs
펜토 바르비탈 나트륨배양 시그마P3761동물 마취
폴리스 포린화이자눈 건조 방지
주사 전자 현미경HitachiS-4800SEM 관찰
가위JZY00030동물 외과 절개
6-웰 플레이트열140675UCMSC의 배
양 스티치JinhuanF603봉
합사Xy4-0봉송
온도 조절 장비GrantV-0001-0005수조
UCMSCsBai'ao& 주의;UKK220201상업적으로 UCMSCs
비타민 CDiyibioDY40138-25g골재 유도
크실렌SCR10023418탈수 골재
자

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hall, B. K., Miyake, T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. The International Journal of Developmental Biology. 39 (6), 881-893 (1995).
  2. Hall, B. K., Miyake, T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Stem CellsStem Cell AggregatesSelf Assembled AggregatesTissue EngineeringRegenerative MedicineCell EngraftmentExtracellular MatrixCell Cell InteractionsUmbilical Cord MSCsCranial Bone Regeneration
Video Coming Soon

Related Articles