실험적으로 진화한 개체군에서 구조적 변이의 역학을 따릅니다.

Summary

우리는 실험적 진화 동결 아카이브에 쉽게 적응할 수 있는 비단일 뉴클레오티드 다형성 대립유전자 역학을 추적하는 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 삼중항 PCR 기술은 실험적 진화 과정에서 삽입 대립 유전자의 상대적 빈도를 정량화하기 위해 자동화된 병렬 모세관 전기영동과 결합되었습니다.

Abstract

구조적 변이체(SV)(즉, 결실, 삽입, 복제 및 반전)는 이제 표현형 변이에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 결과적으로 질병 결정 또는 새로운 환경에 대한 적응과 같은 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 단일 뉴클레오티드 변이체는 SV보다 훨씬 더 많은 관심을 받는데, 이는 아마도 검출하기 쉽고 표현형 효과를 예측하기 쉽기 때문일 것입니다. 단거리 및 장판독 심층 염기서열 분석 기술의 개발로 SV 검출이 크게 향상되었지만, 풀링된 염기서열 분석(poolseq) 데이터에서 SV의 빈도를 정량화하는 것은 여전히 기술적으로 복잡하고 비용이 많이 듭니다.

여기에서 우리는 연구자들이 SV 대립 유전자 빈도의 역학을 따를 수 있도록 하는 다소 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 적용의 예로서, 우리는 박테리아의 실험적 진화 집단에서 삽입 서열(IS) 삽입 빈도를 따릅니다. 이 방법은 야생형(WT)과 파생 대립유전자의 증폭에 의해 생성된 앰플리콘의 크기가 5% 이상 다르고 증폭 효율이 유사하도록 구조적 변이체 경계 주변의 프라이머 삼중체 설계를 기반으로 합니다. 그런 다음 각 앰플리콘의 양은 평행 모세관 전기영동에 의해 결정되고 보정 곡선으로 정규화됩니다. 이 방법은 다른 구조적 변이(결실, 복제 및 반전)의 빈도 정량화와 환자 내 병원체 개체군을 포함한 자연 개체군의 풀-시퀀스 접근 방식으로 쉽게 확장할 수 있습니다.

Introduction

구조적 변이체(SV)는 게놈 서열의 변경으로, 일반적으로 50bp 이상에 영향을 미칩니다. 설명된 SV의 네 가지 범주는 큰 삽입, 큰 삭제, 반전 및 중복입니다. 최근까지 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)의 표현형 효과와 질병의 유전적 결정 요인으로서의 역할 또는 적응에 대한 기여 측면에서 구조적 변이체보다 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)에 더 많은 관심이 기울여졌습니다. 이것은 아마도 SNV를 감지하고 표현형 효과를 예측하는 것이 더 쉽기 때문일 것입니다. 그러나 단거리 및 장판독 심층 염기서열 분석 기술은 적어도 단일 개인 또는 클론 게놈에서 SV의 검출을 크게 개선했습니다¹. 이와 동시에, 이들의 표현형 효과는 더 잘 특성화되었으며, 인간 질병^2,3 또는 새로운 환경⁴에 대한 적응의 유전적 결정인자로서의 의미에 대한 많은 예가 문서화되었습니다.

종종 이동 유전 요소(MGE) 삽입으로 인한 결실 및 삽입은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)보다 훨씬 더 파괴적이며 프레임시프트 돌연변이 및 단백질 구조 변형으로 이어집니다. 유전자 내의 결실 및 MGE....

Protocol

이 프로토콜을 설정하려면 조상 서열 내의 삽입, 삭제, 반전 또는 복제 지점에 대한 정확한 지식이 필요합니다. 이 정보는 일반적으로 종점 또는 중간점 샘플의 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에 의해 얻어집니다. 다음 프로토콜에서는 삽입 돌연변이의 경우에 대한 일반 원칙이 각 단계에 대해 제공되며, 대장균의 실험적 진화 집단에서 mutS 유전자에 IS10 삽입 빈도를 따르는 대표적인 사례가 있습니다. 이 모집단에서 종점 모집단의 WGS는 위치 2,463과 2,471 사이에 1,329bp IS10의 삽입을 식별하여 이 삽입 부위의 중복을 초래했습니다. 이 방법은 세 가지 다른 SV 유형에 적용할 수 있으며 각 경우의 특수성은 논의에서 제공됩니다.

1. 삼중항 프라이머의 설계

1. 고전적인 프라이머 설계 방법(18-24bp, 40%-60% GC 함량, 가능한 경우 G/C 쌍으로 시작/종료,_Tm 차이< 5°C)을 사용하여 프라이머 FW1 및 RV1을 생산합니다. 돌연변이 대립유전자 삽입 부위 주변의 WT 대립유전자에서 짧은 앰플리콘을 증폭하기 위한 프라이머를 설계합니다(그림 1).
   참고: 앰플리콘 크기는 ....

Results

조상 클론에서 추출한 DNA와 1,000세대의 S2.11 집단에서 분리된 과돌연변이 클론을 사용하여 그림 2에 표시된 보정 곡선을 설정했습니다. 실험실에서 준비한 DNA 혼합물의 실제 돌연변이 비율과 평행 모세관 전기영동 기기로 측정한 값은 기울기 1.0706의 선형 관계와 R² 0.9705로 연결되었습니다. 또한 생물학적 복제물 사이에는 좋은 일치가 있었습니다. 표준 편차는 표준 곡선의 9개 점에서 0.61에서 17.74 사이였습니다.

그림 2

Discussion

여기에서 우리는 실험적 진화 집단에서 새로운 적응 SV 대립 유전자의 역학을 따를 수 있는 비용 효율적인 방법을 제안했습니다. 이 방법은 고전적인 PCR 기술과 자동화된 병렬 모세관 전기영동을 결합하여 두 대립 유전자의 상대적인 양을 측정할 수 있습니다. 일단 설정되면 많은 샘플에서 대립 유전자 비율을 병렬로 정량화할 수 있으며 WGS보다 훨씬 저렴합니다. 이 방법은 non-SNP 돌연변이에 대한 앰플리콘 시퀀싱과 동등하며 큰 SV의 앰플리콘 시퀀싱의 기술적 한계에 대한 해결책으로 볼 수 있습니다. 우리는 이 방법이 PCR 편향을 극복하는 검량선을 사용하여 비 SNP 돌연변이체의 비율을 정확하게 정량화한다는 것을 보여주었습니다(그림 2).

SV 대립유전자 역학을 특성화하는 것은 병렬 시간 역학을 통해 연결된 돌연변이를 식별하거나 선택 계수를 계산하고 시간에 따른 변이를 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 여기에 제시된 적용 사례.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well skirted PCR plate	4titude	4Ti - 0740	PCR
Agarose 분자 생물학 등급	Eurogentec	EP-0010-05	Agarose gel 전기영동
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit 빠른 가이드 Fragment Analyzer Systems	Agilent		PDF 사용 설명서
버퍼 TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Agarose gel 전기영동
보정된 일회용 접종 루프 및 바늘	LABELIANS	8175CSR40H	세균 배양
Dneasy 혈액 및 조직 키트	Qiagen	69506	DNA 추출
전기영동 전원 공급 장치	Amilabo	ST606T	Agarose 젤 전기영동
단편 분석기 자동화 CE 시스템	애질런트		병렬 모세관 전기영동
단편 DNA 래더	애질런트	DNF-396, 범위 1-6000bp	병렬 모세관 전기영동
겐타마이신 황산염 염 생물 시약	시그마-알드리치	G1264-1G	박테리아 배양
고감도 희석제 마커	애질런트	DNF-373	병렬 모세관 전기영
고감도 NGS 정량 분석 키트	Agilent	DNF-474	병렬 모세관 전기영동
래더 빠른 로드 1 kb 플러스 DNA 래더	NEB	N0469S	아가로스 젤 전기영동
LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	박테리아 배양
마스터 믹스 PCR 고충실도 Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
프라이머	Eurogentec		PCR
Prosize 데이터 분석 소프트웨어 v.4	Agilent	V.4	Parallel capillary 전기영동
Qubit 분석	Invitrogen	MAN0010876	DNA 정량화
Qubit dsDNA HS 어세이 키트	LIFE TECHNOLOGIES, SAS	Q32854	DNA 정량화
, Thermocycler	Eppendorf	Ep gradients,	PCR
, UVbox, eBOX, VX5	Vilber Lourmat		Agarose gel, 전기영동, 시각화
주사 준비용 물	Aguettant	PROAMP	PCR