방법 논문

신장 질환을 연구하기 위한 새로운 중개 접근법

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DOI:

10.3791/64711

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2022년 8월 30일

 ,  , 
1Department of Urology, University of Alabama at Birmingham

이 논문에서

초록

논의된 기사:

Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T., 칼슘 형광단 표지 및 나노입자 추적 분석을 사용한 인간의 소변 나노결정 추정. 시각화 실험 저널. (168), e62192 (2021).

둘라미스, I. P. 외. 일시적인 양측 신동맥 폐색에 의한 급성 신장 손상에 대한 대형 동물 모델. 시각화 실험 저널. (168), e62230 (2021).

Taguchi, K., Sugahara, S., Elias, BC, Brooks, CR 브레펠딘 A 주사에 의한 신장 내 분비 단백질의 공급원 확인. 시각화 실험 저널. (177), e63178 (2021).

야나이, K. 외. 연령 의존성 신장애가 있는 마우스의 신장 및 혈청에서 microRNA 발현에 대한 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 평가. 시각화 실험 저널. (182), e63258 (2022).

홈즈, HL 외. 마우스 신장의 생체 내 분석을 위한 3D 로봇 초음파 사용. 시각화 실험 저널. (174), e62682 (2021).

Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Morishita, Y. 여러 신장 질환 마우스 모델에서 폴리에틸렌니민 나노입자를 사용하여 외인성 인공적으로 합성된 miRNA 모방체를 신장에 전달합니다. 시각화 실험 저널. (183), e63302 (2022).

Wagner, MC, Sandoval, RM, Campos-Bilderback, SB, Molitoris, BA 2광자 현미경을 사용하여 사구체 과정에 대한 만성 편측 요관 폐쇄의 영향을 정량화합니다. 시각화 실험 저널. (181), e63329 (2022).

사설

소개
신장학 분야의 연구는 신장 질환의 영향을 받는 개인의 웰빙을 크게 향상시켰습니다. 그러나 신장 질환은 인구의 10% 이상에 영향을 미치는 여전히 주요 의료 문제이며 전 세계적으로 의료 비용과 사망률 증가의 원인이 됩니다1. 불행히도 신장 질환으로 이어지는 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이 JoVE 방법 컬렉션 은 신장 병태생리학을 정의하기 위한 최근 전략을 강조합니다. 구체적으로, 연구그룹은 실험 모델이나 임상 샘플을 사용하여 신장 질환을 평가하거나 치료하는 새로운 동물 모델과 방법을 제시합니다. 이 컬렉션에 제시된 연구는 신장학 분야에 대한 또 다른 훌륭한 공헌 시리즈이며 향후 신장 질환을 예방, 진단 또는 치료할 수 있는 새로운 길을 제공할 수 있습니다.

급성 신장 손상의 중개 동물 모델
급성 신장 손상(AKI)은 신장 질환의 일반적인 형태입니다2. 신장 허혈/재관류(I/R) 손상을 연구하기 위해 여러 실험 모델이 사용되었습니다 3,4,5. 그러나 임상 환경을 개선하기 위해 이러한 결과를 번역하는 것은 종 간에 상당한 차이가 있기 때문에 많은 어려움을 안겨주었습니다6. Doulamis et al. 이 문제를 해결하기 위해 양측 풍선 카테터를 사용하여 돼지 신장 I/R 모델을 개발했습니다7. 그들의 모델은 재현성이 높았고, 소변량과 추정 사구체 여과율을 감소시키고, 동물의 혈장 크레아티닌 및 혈중 요소 질소 수치를 증가시켰습니다. 또한, 육안적 조직 및 조직학적 검사에서 신장 내 경색과 출혈이 나타났습니다. 이 새로운 모델은 임상적으로 관련이 있으며 인간의 AKI를 더 깊이 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

신장 질환과 관련된 세포 메커니즘을 조사하기 위한 전략
사이토카인은 신장 손상 및 복구에 기여할 수 있습니다8. 따라서 신장 내 사이토카인의 출처와 역할을 식별하는 것이 중요합니다. Taguchiet al. AKI 및 만성 신장 질환 마우스 모델에서 단백질 분비 억제제인 brefeldin A(BFA)를 사용하여 단백질 분비를 이해하는 기술을 개발했습니다9. 그들은 생쥐의 꼬리 정맥에 BFA를 주입한 후 면역형광 염색을 사용하여 신장을 평가했습니다. 그들은 BFA가 단백질 분비를 억제하고 세포 특이적 마커를 사용하여 특정 세포 유형에서 사이토카인 축적을 유발한다는 것을 확인했습니다. 이 혁신적인 프로토콜은 여러 신장 병리에서 단백질 분비를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

신장 질환에 기여하는 것으로 생각되는 또 다른 제안된 메커니즘은 mRNA 전사를 분해하고 억제하는 것으로 알려진 마이크로RNA(miRNA)10입니다. 조직에서의 miRNA 발현과 인간의 혈청 사이에는 상관관계가 있는 것으로 보고되었다11. 그러나 마우스 신장과 혈청 miRNA를 모두 정제하고 정량화하는 방법은 없습니다. Yanai et al. 연령 의존성 신장애가 있는 마우스의 신장 및 혈청에서 miRNA 발현을 평가하기 위해 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 방법을 최적화했습니다12. 그들은 또한 두 miRNA 수준 사이의 상관관계를 확립했습니다. 이 프로토콜은 처리량이 높으며 많은 병리학적 조건에 적용할 수 있습니다.

신장 질환을 평가하기 위한 새로운 영상 기술
신장의 비침습적 영상은 구조적 및 기능적 결함을 평가할 수 있습니다. 그러나 현재 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이를 우회하기 위해 Holmes et al. 신장, 간 및 심장 기능을 정량화하기 위해 로봇 초음파(US) 기술을 기반으로 간단하고 비용 효율적인 3D 이미징 기술을 개발했습니다13. 그들의 프로토콜은 일관되게 고품질 이미지를 제공했으며 총 조직, 종양 크기 또는 치료제의 이점을 모니터링할 수 있는 연구에 사용될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 높은 데이터 출력입니다. 예를 들어, 한 번에 세 마리의 쥐를 이미지화하거나 시간당 20-30마리의 쥐를 이미지화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기존의 비침습적 이미징 양식에 대한 빠른 대안입니다.

컬렉션의 또 다른 연구 그룹은 이미징을 사용하여 표면 사구체를 유발하는 손상 모델인 편측 요관 폐쇄(UUO)를 연구했습니다. Wagner et al. 표면 사구체가 발생하는 쥐와 표면 사구체가 발생하지 않는 쥐의 UUO를 모니터링하기 위해 생체 내 2광자 현미경을 사용했습니다14. 2광자 현미경은 신장의 다양한 영역에 대한 침투 깊이와 검사를 증가시킵니다. 저자는 UUO가 염증과 섬유증을 유발하고 쥐 신장의 적혈구 흐름도 감소시킨다는 사실을 발견했습니다. 약물과 염증에 대한 반응으로 혈류, 혈관 수축 및 확장을 정량화하는 것은 이 방법이 제공하는 몇 가지 이점입니다. 종합적으로 이러한 연구는 다양한 조직을 연구하기 위한 새로운 이미징 전략을 제공합니다.

신장 질환의 예측 인자로서 나노결정루리아 추정
요로 결정을 평가하는 것이 신장 결석 위험을 예측하는 데 유용할 수 있다고 제안되었습니다15. 우리는 건강한 성인이 소변 옥살산염 수치를 유도하는 것으로 알려진 식이 옥살산염 부하를 섭취하기 전과 후에 소변 나노결정(≤1μm)을 정량화하는 프로토콜을 개발했습니다16. 칼슘 형광단 및 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 칼슘 함유 소변 나노결정을 분리하고 분석했습니다. 우리는 NTA가 소변에서 칼슘 함유 나노결정을 특이적으로 검출할 수 있다고 판단했으며 결과는 이전 연구 결과와 일치했습니다17. 이 프로토콜은 결석 형성자 또는 결정병증이 발생하는 다양한 연구 분야의 소변 나노결정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

신장 질환 치료를 위한 치료적 접근
인공적으로 합성된 miRNA 모방체는 신장 질환의 가능한 치료법으로 제안되었습니다. 그러나 혈청 RNAase는 외인성 miRNA 모방체를 분해할 수 있습니다18. Yanai et al. miRNA 모방체를 마우스의 신장에 안전하게 전달하기 위해 선형 고분자인 폴리에틸렌니민 나노입자(PEI-NP)를 기반으로 하는 비바이러스 벡터를 생산했습니다18. 그들은 모방체가 표적 miRNA를 과발현하는 데 효과적이라는 것을 증명했습니다. 이 방법의 한계에는 더 큰 동물 모델에 필요한 상당한 양의 PEI-NP와 신장에 대한 특이성 부족이 포함됩니다. 그러나 RNA 백신의 성공을 바탕으로 miRNA 모방체는 신장 질환에 대한 이상적인 치료 옵션이 될 수 있습니다.

맺음말
여기에 제시된 포괄적인 연구는 신장학을 둘러싼 널리 퍼진 문제를 연구하기 위한 새로운 동물 모델과 기술을 소개합니다. 이러한 방법 중 일부는 신장 학 이외의 다른 영역에도 적용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 다음 논리적 단계는 이러한 방법을 더 큰 동물 모델 및 임상 시험에서 테스트할 수 있는 방법을 조사하는 것입니다. 우리는 이러한 프로토콜의 공유를 통해 신장 병태생리학에 대한 지식을 확장하고 개인의 신장 질환을 완화하기 위한 새로운 아이디어를 탄생시킬 수 있기를 바랍니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 컬렉션에 기여해 주신 저자와 평론가에게 감사드립니다. 또한 NIH(DK106284 및 DK123542) 및 Oxalosis &; Hyperoxaluria Foundation – American Society of Nephrology KidneyCure: Transition to Independence Grant의 자금 지원을 인정합니다.

참고문헌

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  7. Doulamis, I. P., et al. A large animal model for acute kidney injury by temporary bilateral renal artery occlusion. Journal of Visualized Experiments. (168), e62230(2021).
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  12. Yanai, K., et al. Quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microRNA expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment. Journal of Visualized Experiments. (182), e63258(2022).
  13. Holmes, H. L., et al. Use of 3D robotic ultrasound for in vivo analysis of mouse kidneys. Journal of Visualized Experiments. (174), e62682(2021).
  14. Wagner, M. C., Sandoval, R. M., Campos-Bilderback, S. B., Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63329(2022).
  15. Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
  16. Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T. Estimation of urinary nanocrystals in humans using calcium fluorophore labeling and nanoparticle tracking analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e62192(2021).
  17. Kumar, P., et al. Dietary oxalate loading impacts monocyte metabolism and inflammatory signaling in humans. Frontiers in Immunology. 12, 617508(2021).
  18. Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Morishita, Y. Delivery of exogenous artificially synthesized miRNA mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. Journal of Visualized Experiments. (183), e63302(2022).

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