살아있는 세포에서 ALDH1A1 활성을 측정하는 방법은 줄기의 바이오마커로서의 지위로 인해 암 연구에서 매우 중요합니다. 이 연구에서 우리는 5개의 난소암 세포주 패널에서 ALDH1A1 활성의 상대적 수준을 결정하기 위해 동형 선택적 형광 프로브를 사용했습니다.
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방법 논문
알데히드 탈수소효소 1A1 활성을 기반으로 난소암 세포를 계층화하기 위한 AlDeSense 적용
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
암 치료 후 재발은 종종 암 줄기 세포(CSC)로 알려진 종양 세포 하위 집단의 지속성에 기인하며, 이는 놀라운 종양 개시 및 자가 재생 능력을 특징으로 합니다. 종양(예: 난소)의 기원에 따라 CSC 표면 바이오마커 프로파일이 크게 달라질 수 있으므로 면역조직화학적 염색을 통해 이러한 세포를 식별하는 것은 어려운 일입니다. 반대로, 알데히드 탈수소효소 1A1(ALDH1A1)은 CSC를 포함한 거의 모든 전구 세포에서 보존된 발현 프로필로 인해 CSC를 식별하는 우수한 마커로 부상했습니다. ALDH1A1 이소형은 다양한 내인성 및 생체 이물 알데히드를 해당 카르복실산 생성물로 산화시키는 19개 효소의 슈퍼패밀리에 속합니다. Chan et al. 최근 ALDH1A1 활성 검출을 위한 동형 선택적 "턴온" 프로브인 AlDeSense와 비표적 염색을 설명하기 위한 비반응성 매칭 제어 시약(Ctrl-AlDeSense)을 개발했습니다. 이 동형 선택적 도구는 K562 골수성 백혈병 세포, 유방구 및 흑색종 유래 CSC 이종이식편에서 ALDH1A1 활성의 검출을 통해 다재다능한 화학 도구임이 이미 입증되었습니다. 이 기사에서는 5개의 난소암 세포주 패널에서 상대적인 ALDH1A1 활성을 측정하는 추가 형광 측정법, 공초점 현미경 및 유세포 분석 실험을 통해 프로브의 유용성을 보여주었습니다.
서론
암 줄기 세포(CSC)는 줄기 세포와 유사한 특성을 나타내는 종양 세포의 하위 집단입니다1. 비암성 환자와 마찬가지로 CSC는 자가 재생 및 증식 능력이 뛰어납니다. ATP 결합 카세트 수송체의 상향 조절과 같은 다른 내장 메커니즘과 함께 CSC는 종종 초기 외과적 용적축소 노력과 후속 보조 요법에서 벗어날 수 있습니다2. CSC는 치료 저항성3, 재발4 및 전이5에서 중요한 역할을 하기 때문에 암 연구에서 우선 순위가 되었습니다. CSCs6를 식별하는데 사용될 수 있는 다양한 세포 표면 항원(예: CD133)이 존재하지만, 세포질에서 발견되는 알데히드 탈수소효소(ALDH)의 효소 활성을 활용하는 것이매력적인 대안으로 떠올랐다7. ALDH는 반응성 내인성 알데히드와 생체이물성 알데히드의 산화를 촉매하는 역할을 하는 19가지 효소의 슈퍼패밀리이다8.
일반적으로 알데히드 해독은 줄기 세포의 무결성을 손상시킬 ....
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프로토콜
1. 형광 측정을 통해 난소암 세포 균질액의 총 ALDH1A1 활성 측정
- T25 세포 배양 플라스크에서 1 ×10 6 세포를 다음 세포 배양 배지 5 mL에서 해동합니다.
- IGROV-1 및 PEO4: 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 포함된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지.
- BG-1 및 Caov-3: 10% FBS 및 1% P/S를 갖는 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium).
- OVCAR-3: 20% FBS, 1% P/S 및 0.01mg/mL 인슐린을 함유한 RPMI 1640.
- 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 2 내지 3 계대 동안 인큐베이터에 유지한다. 통과하기 전에 셀이 80%-90% 밀도를 초과하지 않는지 확인하십시오.
- 세포를 0.25% 트립신에서 10분 동안 트립신화하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 계수하고, 25°C에서 5분 동안 원심분리(180 × g)를 통해 펠렛 1 ×10 7 세포를 계수합니다. <....
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결과
난소암 세포 균질액의 총 ALDH1A1 활성
이 분석으로부터 얻어진 각각의 세포주에 대한 평균 폴드 턴온은 다음과 같다: BG-1 (1.12 ± 0.01); IGROV-1 (1.30 ± 0.03); Caov-3 (1.72 ± 0.06); PEO4 (2.51 ± 0.29); 및 OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (그림 2).
그림 2: 형광 측정법으로 측정한 각 난소암 세포주의 균질액에서 동형-선택적 염료의 형광 켜기(평균 ± 표준 편차)(n = 3).
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토론
범 선택성은 많은 ALDH 프로브의 주요 제한 사항입니다. 그러나, 몇몇 이소형-선택적인 예가 최근에 보고되었다 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. 이 연구에 사용된 동형-선택적 형광 프로브는 다량으로 존재하는 경쟁 효소의 존재 하에서도 ALDH1A1 동형과만 반응하는 합리적으로 설계된 최초의 프로브를 나타냅니다<.......
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공개 사항
AlDeSense 기술에 대한 출원 중인 특허(US20200199092A1)를 공개합니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건원 (R35GM133581에서 JC로)과 일리노이 암 센터 대학원 장학금 (SG에 수여)의 지원을 받았습니다. JC는 카밀과 헨리 드레퓌스 재단의 지원에 감사드립니다. 저자는 AlDeSense 및 AlDeSense AM의 재고 준비에 초기 기여를 한 Thomas E. Bearrood 박사에게 감사드립니다. 다양한 합성 전구체를 준비하는 데 도움을 주신 Oliver D. Pichardo Peguero 씨와 Joseph A. Forzano 씨에게 감사드립니다. Caov-3, IGROV-1 및 PEO4 세포에 대해 Erik Nelson 교수(UIUC 분자 및 통합 생리학과)에게 감사드립니다. BG-1 세포에 대해 Paul Hergenrother 교수(UIUC 화학과)에게 감사드립니다. Zeiss LSM 700 컨포칼 현미경 및 해당 소프트웨어를 이용할 수 있도록 해주신 Carl R. Woese 게놈 생물학 연구소의 핵심 시설에 감사드립니다. BD LSR II CMtO 분석기를 사용해 주신 유세포 분석 시설에 감사드립니다. 세포 배양 배지 준비에 도움을 주신 Sandra McMasters 박사와 Cell Media Facility에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 칼슘, 마그네슘 및 중탄산나트륨 없이 HBSS에서 0.25% 트립신, 0.1% EDTA | Corning | 25-050-CI | |
| 1x 인산염 완충액 식염수 | Corning | 21-040-CMX12 | |
| AccuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| AlDeSense | 합성 사내 | ||
| BG-1 | 일리노이 대학교 어바나-샴페인 교수 Paul Hergenrother Lab에서 제공한 선물 | ||
| BioLite 25cm2 플라스크 | 써모 피셔 사이언티픽 | ||
| Biosafety Cabinet 1300 시리즈 A2 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Caov-3 | of Illinois Urbana-Champaign | ||
| Cell homogenizer | Fisher Scientific | ||
| Centrifuge 5180R | Eppendorf | 22627040 | |
| Contrl-AlDeSense | Synthesized in-house | ||
| DMEM, 10% FBS, 1% P/S | UIUC cell에서 제공 미디어 시설 | ||
| Falcon Round-Bottom 폴리스티렌 테스트 튜브, Cell Strainer Snap Cap, 5mL | Corning | 352003 | |
| FCS Express 6 | 제공 UIUC CMtO | ||
| FL 현미경 | EVOS | ||
| 형광계 | Photon Technology International | ||
| Forma Series II Water-Jacketed CO2 인큐베이터 | Fisher Scientific | 3110 | |
| IGROV-1 | 일리노이 대학교 어바나-샴페인 캠퍼스 Erik Nelson 교수 연구실에서 제공한 선물 | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Innova 42R 인큐베이션 쉐이커 | |||
| LSM 700 | Zeiss | ||
| LSR II | BD | ||
| Nunc Lab-Tek 챔버 #1.0 보로실레이트 커버글라스 시스템 | Thermo Fisher Scientific | ||
| OVCAR-3 | ATCC | HTB-161 | |
| PEO4 | 리노이 대학교 Erik Nelson 연구소 교수가 제공한 선물 Urbana-Champaign | ||
| Pierce Protease Inhibitor | Tablets Thermo Scientific | A32963 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Rocker | VWR | ||
| RPMI, 10% FBS, 1% P/S | UIUC 세포 배지 시설에서 제조 | ||
| RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0.01 mg/mL 인슐린 | UIUC 세포 배지 시설에서 제조 |
참고문헌
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC tr....
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재인쇄 및 허가
