콜라겐의 표면 고정화(Surface Immobilization) 및 콜라겐 결합 분석(Collagen Binding Assay)을 위한 최적화된 방법

Summary

이 연구는 유형 I 및 III 콜라겐을 마이크로플레이트에 재현성 있게 고정시키고 정량화하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시한 다음, 시간 분해 형광 방법을 사용하여 콜라겐-화합물 상호 작용을 연구하기 위한 개선된 체외 결합 분석 프로토콜을 제시합니다. 후속 단계별 데이터 분석 및 데이터 해석이 제공됩니다.

Abstract

섬유증은 부상이나 손상에 대한 회복 반응으로 다양한 조직에서 발생합니다. 그러나 섬유증이 과도하게 발생하면 조직 흉터와 장기 부전으로 이어질 수 있으며, 이는 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 콜라겐은 섬유증의 핵심 원인이며, I형 및 III형 콜라겐은 많은 섬유화 질환과 관련된 주요 유형입니다. 다른 단백질(예: 엘라스틴, 알부민, 피브로넥틴 등)을 고정시키는 데 사용되는 기존 프로토콜과 달리, 안정적인 코팅을 생성하기 위해 다양한 유형의 콜라겐을 재현성 있게 고정시키는 포괄적인 프로토콜은 쉽게 사용할 수 없습니다. 콜라겐을 고정시키는 것은 콜라겐의 유형, pH, 온도 및 사용된 마이크로플레이트의 유형을 포함한 여러 실험 조건이 고정의 효율성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 놀라울 정도로 어렵습니다. 여기에서는 유형 I 및 III 콜라겐을 재현성 있게 고정하고 정량화하여 안정적이고 재현 가능한 겔/필름을 생성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 또한 이 연구는 콜라겐과 후보 콜라겐 결합 화합물(예: 유로퓸[Eu(III)]을 운반하는 금속 킬레이트에 접합된 펩타이드) 간의 상호 작용을 조사하기 위해 체외 시간 분해 형광 결합 연구를 수행, 분석 및 해석하는 방법을 보여줍니다. 이러한 접근 방식은 표적 이미징 프로브를 개발하기 위한 분자 이미징 분야, 약물 개발, 세포 독성 연구, 세포 증식 연구 및 면역 분석을 포함한 다양한 생물 의학 응용 분야에 보편적으로 적용될 수 있습니다.

Introduction

조직 손상 후 자연적인 상처 치유 과정의 일부로 섬유성 결합 조직이 축적되는 것을 섬유증이라고 합니다. 그러나 섬유조직의 침착이 종결되지 않고 조직 복구에 필요한 수준을 넘어서 계속되면 섬유증이 과도하게 됩니다 ^1,2. 과도한 섬유증은 장기 생리와 기능을 손상시키고 장기 손상과 잠재적인 장기 부전을 유발할 수 있다 ^3,4,5. 섬유증의 두 가지 주요 원인은 세포외 기질(ECM) 단백질인 콜라겐 I형과^III형입니다 6. 콜라겐은 인체 총 단백질 함량의 약 1/3을 구성하는 다양한 장기에서 발견되는 구조 단백질입니다¹. 인간 게놈 염기서열 분석으로 확인된 콜라겐에는 28가지 유형이 있으며, 그 중 가장 풍부한 콜라겐은 섬유소 콜라겐입니다⁷. 1차 섬유질 콜라겐은 I형 콜라겐으로, ECM에 인장 강도와 변형에 대한 저항성을 제공합니다⁸. III형 콜라겐은 탄력을 제공하고 I형 콜라겐과 공동 국소화하는 구조적 구성 요소입니다. 배아 형성 과정에서 발현되며 성인 피부, 근육 및 혈관에서 소량으로 자연적으로 발견됩니다⁹.

생체 내 콜라겐 합성은 mRNA가 핵에서 전사된 다음 세포질로 이동하여 번역되는 세포 내 과정으로 시작됩니다. 번역 후, 형성된 사슬은 소포체에서 번역 후 변형을 겪으며, 여기서 프로 콜라겐(콜라겐의 전구체)이 형성됩니다. 그런 다음 프로 콜라겐은 세포 외 공간으로 배설되기 전에 최종 변형을 위해 골지체로 이동합니다¹⁰. 단백질 분해 분열을 통해 프로 콜라겐은 트로포콜라겐으로 변형됩니다. 그런 다음 효소 lysyl oxidase(LOX)에 의해 촉매된 효소 매개 가교 경로를 통해 또는 Maillard 반응¹¹을 포함하는 비효소 매개 가교 경로를 통해 가교됩니다. 콜라겐을 고정시키기 위한 체외 프로토콜은 주로 콜라겐이 스스로 조립하는 능력에 의존합니다. 콜라겐은 용해도에 따라 조직에서 추출되며, 이는 주로 개별 콜라겐 원섬유의 가교 정도에 따라 달라집니다⁷. 섬유소 콜라겐은 아세트산에 용해되어 있으며, pH와 온도가 조절되면 섬유섬유가 재형성될 수 있다¹². 체외(in vitro)에서 콜라겐의 섬유형성은 2단계 과정으로 볼 수 있다⁷. 첫 번째 단계는 핵형성 단계로, 콜라겐 섬유가 이량체와 삼량체 원섬유를 형성한 후 재배열되어 삼중 나선 구조를 형성하는 단계입니다. 두 번째 단계는 성장 단계로, 원섬유가 측면으로 성장하기 시작하여 일반적으로 탁도⁷의 변화에 의해 관찰되는 특징적인 D-밴드 형성을 초래합니다. 원자력 현미경(Atomic Force Microscopy, AFM) 연구는 또한 제1형 콜라겐과 제3형 콜라겐이 서로 다른 특성을 가지고 있음을 밝혔습니다(표 1)¹³.

콜라겐과 다른 화합물 사이의 결합 상호 작용을 연구하려면 콜라겐을 마이크로플레이트의 웰에 재현 가능하게 고정화해야 합니다. 용해성 콜라겐을 고정시키기 위한 다양한 프로토콜이 있습니다 14,15,16. 콜라겐으로 사전 코팅된 시판되는 마이크로플레이트는 일반적으로 세포 배양에 사용됩니다. 그러나 사전 코팅된 마이크로플레이트는 웰에 코팅된 알 수 없는 양의 콜라겐이 매우 얇게 형성되어 있어 체외 결합 분석에 적합하지 않습니다. 콜라겐을 플레이트 웰에 고정시킬 때 몇 가지 문제가 있습니다. 주요 과제 중 하나는 적절한 유형의 마이크로플레이트를 선택하는 것인데, 그 이유는 다양한 유형의 콜라겐(예: I형 및 III형)은 서로 다른 화학적 특성을 가지므로 마이크로플레이트의 재료에 따라 더 안정적이고 효과적으로 고정되기 때문입니다. 또 다른 과제는 고정화 프로토콜의 실험 조건인데, 섬유형성 과정은 온도, pH, 콜라겐의 스톡 농도 및 완충액⁷의 이온 농도를 포함한 여러 요인에 따라 달라지기 때문입니다.

콜라겐(표적)과 다른 화합물(즉, 표적 펩타이드) 간의 상호 작용을 연구하기 위해서는 해리 상수 K_d를 측정하여 표적에 대한 화합물의 특이성과 선택성을 조사하기 위한 강력한 스크리닝 분석을 개발해야 합니다. 단백질(콜라겐)과 리간드 사이의 이분자 복합체 형성 평형 위치는 결합 친화도에 비례하는 결합 상수 K_a로 표현됩니다. 그러나 가장 일반적으로 생화학자들은 K_d = 1/K_a (_{K d} 및_{K a}의 역수)로 정의되는 이분자 복합체의 평형 해리 상수 K_d 의 관점에서 친화력 관계를 표현합니다. K_d 값이 낮을수록 단백질과 리간드 사이의 결합 강도가 강해집니다. K_d를 사용하여 동일한 단백질에 대한 다른 리간드의 결합 친화도를 비교하는 이점(또는 그 반대의 경우)은 이분자 복합체에 대한 K_d의 단위가 mol/L(즉, 농도 단위)이라는 사실과 관련이 있습니다. 대부분의 실험 조건에서 K_d 값은 평형^17,18에서 타겟에서 사용 가능한 결합 부위의 50% 포화로 이어지는 리간드 농도에 해당합니다. 해리 상수는 일반적으로 수용체 분획 점유(FO)를 분석하여 추출되며, 이는 점유된 결합 부위와 사용 가능한 총 결합 부위 간의 비율로 리간드 농도의 함수로 정의됩니다. 이는 결합된 리간드의 양을 구별하고 측정할 수 있는 분석 분석을 사용할 수 있는 경우 수행할 수 있습니다.

시험관 내 리간드 결합 분석은 광학 광도 측정법, 방사 리간드 방법, 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS) 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 포함한 다양한 생물 분석 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 광도 측정 방법 중 형광 방출을 기반으로 하는 방법은 일반적으로 감도를 높이고 분석의 검출 한계를 개선하기 위해 형광단으로 리간드 또는 단백질을 라벨링해야 합니다. Eu(III)와 같은 특정 란탄족(III) 이온의 킬레이트는 큰 스톡스 이동, 좁은 방출 대역(우수한 신호 대 잡음비 제공), 제한된 광표백 및 긴 방출 수명을 가지고 있기 때문에 형광단으로서 매우 매력적입니다. 중요한 것은 후자의 특성으로 인해 Eu(III) 형광단의 시간 분해 형광(TRF)을 사용하여 배경 자가형광을 제거할 수 있다는 것입니다¹⁹. Eu(III) 기반 TRF 분석의 DELFIA(dissociation-enhanced lanthanide fluorescent immunoassay) 버전에서 비발광 Eu(III)-킬레이트로 표지된 리간드는 수용체가 마이크로플레이트에 고정된 상태로 배양됩니다. 표지된 리간드/수용체 복합체는 결합되지 않은 리간드에서 분리되고, Eu(III) 형광은 산성 pH에서 Eu(III) 복합체의 해리에 의해 활성화된 후 형광 강화 킬레이터로 재착체화하여 미셀 함유, 고형광 Eu(III) 복합체를 형성합니다²⁰.

탈착화 단계는 빠른 탈복잡성 역학을 보여주는 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트(DTPA)와 같은 킬레이트를 사용하여 합리적으로 달성할 수 있습니다. 그러나 DOTA (1,4,7,10- 테트라 아자사이클로 도데칸 1,4,7,10- 테트라 아세트산) 및 모노 아미드 유도체 (DO3AAm)와 같은 특정 거대 고리 킬레이터가있는 Eu (III) 복합체는 높은 열역학적 안정성과 매우 높은 운동 불활성을 보여줍니다. 이 경우 Eu(III) 기반 TRF²¹의 충분하고 재현 가능한 활성화를 달성하기 위해 분해 단계를 정확하게 최적화해야 합니다. 란탄족(Ln(III))-DOTA 및 Ln(III)-DO3AAm 복합체는 자기공명영상(MRI) 기술에 의한 생체 내 분자 이미징을 위한 조영제로 가장 일반적으로 사용되는 복합체라는 점에 주목할 가치가 있습니다²². 따라서 Ln(III) 기반 TRF 분석은 MRI 분자 프로브와 의도한 생물학적 표적의 결합 친화도를 체외에서 연구하기 위해 선택되는 도구입니다. 현재 I형 및 III형 콜라겐을 고정하기 위한 포괄적이고 재현 가능한 프로토콜과 체외 결합 Eu(III) TRF 실험을 수행하기 위한 재현 가능한 파이프라인이 부족합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 I형 및 III형 콜라겐을 자가 조립 및 고정화하고 체외 결합 분석에 필요한 충분한 농도의 콜라겐으로 각각 안정적인 젤 및 필름을 생성하는 재현 가능한 방법이 개발되었습니다. 고불활성 Eu(III)-DO3Aam 기반 복합체의 Eu(III) TRF에 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마지막으로, 고정된 I형 및 III형 콜라겐에 대한 Eu(III) 표지 리간드의 K_d를 측정하기 위해 최적화된 체외 마이크로플레이트 Eu(III) TRF 분석이 입증되었습니다(그림 1).

Protocol

참고: 이 작업에 사용된 모든 제품 정보는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 콜라겐 고정화

참고: 결합 분석 중에 사용된 마이크로플레이트의 각 웰에 교차 형광을 피하기 위해 인접한 웰이 비어 있는지 확인합니다. 프로토콜의 이 부분을 얼음 위에서 수행하십시오.콜라겐은 온도와 pH 수준이 상승하면 스스로 조립되기 때문입니다. 조직 배양 후드와 멸균 조건에서 이 절차를 수행하는데, 이는 마이크로플레이트가 이후에 조직 배양(TC) 인큐베이터에서 배양되기 때문입니다.

1. 96-well 마이크로플레이트에서 I형 콜라겐의 고정화(그림 2)
   1일차
   1. 얼음이 든 실리콘 트레이를 준비합니다. I형 콜라겐이 들어 있는 바이알, 차가운 10x 인산염 완충 식염수(PBS) 및 마이크로플레이트를 얼음 위에 놓고 모든 것에 70% 에탄올을 뿌립니다. TC 후드 아래에 재료를 놓습니다.
   2. 동일한 부피의 I형 콜라겐과 10x PBS(pH 7.4)를 사용하여 콜라겐을 중화합니다.
   3. 용액을 몇 번 뒤집어 거품이 형성되지 않도록 합니다.
   4. 100 μL의 중화된 콜라겐을 마이크로플레이트의 다른 모든 웰과 다른 모든 열에 첨가하고 37°C에서 18-20시간 동안 배양하여 콜라겐을 건조하게 증발시킵니다.
      2일차
   5. 100μL의 1x PBS, pH 7.4로 마이크로플레이트를 2회 세척하여 결합되지 않은 콜라겐을 제거합니다.
   6. 마이크로플레이트를 37°C의 인큐베이터로 옮기고 2시간 더 건조시킨 후 추가 결합 실험에 사용합니다.
2. 96웰 마이크로플레이트에서 콜라겐 유형 III의 고정화(그림 3)
   1일차
   1. 얼음이 든 실리콘 트레이를 준비합니다. III형 콜라겐이 들어 있는 바이알, 차가운 10x PBS, 마이크로플레이트를 얼음 위에 놓고 70% 에탄올을 모두 뿌립니다. TC 후드 아래에 재료를 놓습니다.
   2. 동일한 부피의 III형 콜라겐과 10x PBS(pH 7.4)를 사용하여 콜라겐을 중화합니다.
   3. 70 μL의 중화된 콜라겐을 마이크로플레이트의 다른 모든 웰과 다른 모든 행에 첨가하고, 37 °C에서 2시간 동안 배양하기 위해 조직 배양 후드 아래에 마이크로플레이트를 배치하여 콜라겐을 건조하게 증발시킵니다.
      2일차
   4. 70μL의 1x PBS, pH 7.4로 마이크로플레이트를 두 번 세척하여 결합되지 않은 콜라겐을 제거합니다.
   5. 37°C에서 1시간 동안 마이크로플레이트를 인큐베이터로 옮긴 다음 마이크로플레이트를 벤치로 옮기고 추가 결합 실험에 사용하기 전에 1시간 동안 건조시킵니다.

2. 고정화된 콜라겐 젤/필름의 안정성 평가

1. PBS를 이용한 1시간 배양
   참고: 결합 실험 중에, 고정화된 콜라겐을 관심 화합물과 함께 배양합니다. 생성된 콜라겐 젤 또는 필름의 안정성을 조사하는 것이 중요합니다. 이렇게하려면 세 가지 조건의 안정성을 측정하십시오 : 세척 없음 = 배양 직후 고정 된 콜라겐을 측정합니다. 세척 = 100μL의 PBS로 플레이트를 두 번 세척한 후 고정된 콜라겐을 측정합니다. 그리고 1시간 PBS 모방 & 세척 = PBS로 1시간 동안 배양한 후 PBS로 두 번 세척한 후 고정된 콜라겐을 측정합니다. 아래에서는 PBS 배양 방법에 대해 설명합니다.
   1. 콜라겐으로 코팅된 각 웰에 70μL의 PBS(1x)를 추가하고 마이크로플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 피펫을 사용하여 각 웰에서 여분의 액체를 흡입하고 PBS(1x)로 두 번 세척한 후 아래에 설명된 단백질 정량 분석을 수행합니다.
2. 비신코닌산 분석법(BCA)을 사용한 고정화된 콜라겐의 양 정량화
   참고: 제조업체의 지침에 따라 Pierce BCA 단백질 분석 키트(재료 표)를 사용하십시오. 이 분석에 대한 각각의 콜라겐 표준물질을 만드십시오. 콜라겐 I의 농도 범위는 0-3,000 μg/mL이고 콜라겐 III의 농도 범위는 0-750 μg/mL입니다. 콜라겐당 총 11가지 표준물을 만드십시오.
   1. 제조업체의 지침에 따라 필요한 작업 시약(WR)의 총 부피를 준비합니다.
   2. 각 콜라겐 표준물질 25μL를 마이크로플레이트 웰에 추가합니다(중복). 이러한 솔루션은 표준 곡선을 그리는 데 사용됩니다.
   3. 200μL의 작업 시약 용액을 표준물질이 포함된 각 웰과 알 수 없는 농도의 콜라겐으로 코팅된 웰에 추가합니다.
   4. 마이크로플레이트를 플레이트 셰이커에 30초 동안 놓습니다. 마이크로플레이트를 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   5. 마이크로플레이트를 제거하고 실온에서 식힙니다. 플레이트 리더를 사용하여 560nm에서 흡광도를 측정합니다.
   6. 11개 표준 용액의 농도(μg/mL)에 대해 A₅₆₀ (AU)을 표시하여 검량선을 플로팅하고 검량선을 사용하여 콜라겐의 양을 계산합니다.

3. Europium(III) TRF 리간드 결합 분석(그림 1)

참고: 사용된 화합물은 Eu(III)-DO3AAm-CBP라고 하는 단일 Eu(III)-DO3AAm 복합체로 표지된 후보 콜라겐 결합 펩타이드(CBP)입니다(그림 4).

1. Eu(III)-DO3AAm-CBP 화합물을 사용한 콜라겐 코팅 플레이트의 배양
   1. 1x PBS에서 0.1-15 μM (0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 3 μM, 5 μM, 7 μM, 10 μM 및 15 μM) 범위의 농도로 Eu (III) -DO3AAm-CBP 화합물 용액을 준비합니다.
   2. 각 농도의 화합물 75μL를 콜라겐 코팅된 웰(플레이트 A)에 추가합니다. 콜라겐에 결합하는 화합물의 양을 계산하기 위해 실험을 세 번 수행합니다.
   3. 코팅되지 않은 두 번째 플레이트(플레이트 B)를 사용하고 각 화합물 75μL를 빈 웰에 추가하여 플레이트에 대한 화합물의 비특이적 결합을 계산합니다. 각 농도에 대해 삼중을 사용합니다.
   4. 마이크로플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   5. 피펫을 사용하여 각 웰에서 초과 용액을 흡입 및 폐기하고 1x PBS로 웰을 두 번 세척하여 과량의 결합되지 않은 화합물을 제거합니다. 콜라겐 코팅 마이크로플레이트와 코팅되지 않은 마이크로플레이트를 모두 사용하여 이 단계를 수행합니다.
   6. 코팅되지 않은 세 번째 플레이트(플레이트 C)에 동일한 범위의 Eu(III)-DO3AAm-CBP 농도 10μL(중복)를 추가합니다. 용액 내 Eu(III)-DO3AAm-CBP의 형광 판독값을 사용하여 검량선을 만듭니다.
      알림: 이 플레이트에서 용액을 세척하거나 흡입하지 마십시오.
2. Europium(III) 및 시간 분해 형광(TRF) 판독값의 산 추출
   알림: 산성 용액(AS)과 완충 용액(BS)의 부피 준비 및 보정에 대한 추가 정보를 참조하십시오. 이 작업에서 최적의 pH를 재현성 있게 달성하는 데 필요한 AS 및 BS의 부피는 각각 54μL 및 46μL였습니다. 플레이트 A, 플레이트 B 및 플레이트 C에서 다음 작업을 수행합니다.
   1. 각 웰에 54μL의 산성 용액(AS)을 추가하고 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 90분 동안 놓고 마이크로플레이트를 호일로 덮어 증발을 방지합니다. 재현 가능한 decomplexation을 달성하기 위해 온도와 배양 시간을 신중하게 제어해야 합니다.
   2. 각 웰에 46μL의 완충 용액(BS)을 추가하고 플레이트를 30초 동안 부드럽게 흔듭니다.
   3. 100μL의 강화 용액(ES)을 넣고 플레이트를 30초 동안 흔듭니다.
   4. TRF 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 읽기 전에 30분 동안 기다립니다. 표 2에 나열된 매개변수를 사용합니다.

4. 데이터 분석

1. wells에 고정된 콜라겐 농도의 정량화
   1. 11개 표준 용액의 농도(μg/mL) 대비 A₅₆₀ (AU)의 검량선 방정식을 구합니다.
      1. 콜라겐 표준물질을 포함하는 웰에서 얻은 흡광도 판독값을 사용합니다.
      2. 중복된 웰의 평균값을 표로 만들고 알려진 단백질(콜라겐) 농도(μg/mL)에 대한 평균 흡광도를 표시하여 표준 곡선에 대한 방정식을 구합니다.
   2. 흡광도 값을 사용하여 고정화된 콜라겐의 질량(μg)과 농도(M)를 계산합니다.
      1. 고정화된 콜라겐이 포함된 3개의 웰에서 평균 흡광도 값을 계산하고 표준 편차를 기록합니다.
      2. 콜라겐 표준 곡선(단계 2.2.6)에서 얻은 표준 곡선 방정식을 사용하여 콜라겐 코팅된 웰에서 측정한 흡광도를 조화로 변환합니다. 여기에서 실험 웰 내에 고정된 콜라겐의 농도를 μg/mL 단위로 계산합니다.
      3. 단계 4.1.2.2(μg/mL)에서 계산된 농도를 먼저 그램/리터로 변환한 다음 콜라겐의 분자량에 따라 몰(M)로 변환합니다.
      4. 마지막으로, 농도를 웰에 첨가된 콜라겐의 부피로 나누어 각 웰에 고정된 콜라겐의 질량을 계산합니다(I형 콜라겐의 경우 100μL, III형 콜라겐의 경우 70μL).
2. 해리 상수(K_d) (그림 4)
   1. 형광 판독값을 추출합니다.
      1. 플레이트 리더에서 스프레드시트로 형광 판독값을 내보냅니다.
         참고: 결합 분석에서는 플레이트의 플라스틱 표면에 대한 화합물의 잠재적인 비특이적 결합을 고려하는 것이 중요합니다.
      2. 세 가지 다른 플레이트에 대한 각 화합물 농도에서 3중 측정의 평균값을 계산합니다: 코팅된 웰(플레이트 A)의 특정 결합 판독값, 코팅되지 않은 웰의 비특이적 결합(플레이트 B) 및 코팅되지 않은 웰(플레이트 C)의 용액 내 총 Eu(III)-DO3AAm-CBP.
      3. 코팅되지 않은 웰(플레이트 B)의 형광 판독값과 코팅된 웰(플레이트 A)의 형광 판독값을 빼서 결합된 화합물에 대한 형광 값을 측정합니다.
         방정식 1: 결합된 형광^{측정 17}:
         Bound fluorescnece = 특이적(코팅된 웰) - 불특이적(코팅되지 않은 웰)
      4. Eu(III) 표지된 용액 내 화합물(플레이트 C)의 판독값을 사용하여 검량선을 생성합니다. Eu(III) 표지 화합물의 농도에 대해 얻은 형광 판독값을 플롯합니다. 선형 회귀 피팅을 수행합니다.
   2. 형광 판독값을 농도로 변환합니다.
      1. 용액의 화합물 농도를 사용하여 생성된 데이터로부터 표준 형광 곡선을 사용하여 결합된 형광의 판독값(단계 4.2.3)을 농도로 변환합니다(단계 4.2.1.4).
         참고: 서로 다른 농도에서 고정화되는 다른 표적 단백질에 대한 한 화합물의 결합 특성을 비교할 때, 표적에 결합된 화합물(즉, 결합된 화합물/단백질)의 양을 계산할 때 후자를 고려해야 합니다.
      2. 결합된 화합물의 농도를 웰에 고정된 단백질의 농도로 나눕니다.
         참고: 이 계산을 위해 웰을 PBS로 1시간 동안 배양한 후 계산된 고정식 콜라겐의 농도를 사용합니다(소위 PBS 모방 실험, 위의 섹션 2.1). 이는 배양 단계와 세척 단계에서 최종 형광 신호에 기여하지 않는 콜라겐의 잠재적 손실을 설명하기 위한 것입니다.
      3. x축(μM)에 화합물의 농도가 있고 y축에 결합된 화합물/단백질의 농도가 있는 산점도를 사용하여 데이터를 플로팅합니다.
   3. K_d 값을 구합니다.
      1. 4.2.2.3단계에서 얻은 데이터를 두 가지 가능한 결합 운동 모델(1-site binding 및 hill slopes를 사용한 1-site binding)을 사용하여 맞춥니다. 각 모델에 대한 방정식은 그림 6에 나와 있습니다.
      2. 데이터를 피팅할 때 가장 높은 R-제곱 값으로 모호하지 않은 피팅을 제공하는 모델을 선택합니다.
      3. 플레이트당 농도당 형광 판독값의 각 세트에 대한 이상값(s)을 제외합니다.
      4. 최종 K_d 값을 계산하고 데이터를 독립 실험의 평균 ± 표준 편차로 제시합니다.
         참고: 확실한 결과를 얻으려면 각 플레이트 내에서 3회 측정을 수행하고 서로 다른 마이크로플레이트로 최소 3개의 독립적인 실험을 수행하십시오.
   4. 분수 점유(FO)를 계산합니다.
      참고: 방정식 2에서는 대상의 농도를 알 수 없으므로 대수와 K_d를 사용하여 방정식 3에서 분수 점유를 계산하기 위한 실행 가능한 방정식이 방정식 4의 형태로 발생합니다.
      방정식 2: 분수 점유의 정의¹⁷:
      
      방정식 3: 해리 상수 K_d, 이는 화합물이 평형¹⁷에서 목표의 50%를 차지하는 농도입니다.
      
      방정식 4: FO 방정식¹⁷을 계산하기 위해 방정식을 재배열함:
      
      1. 각 개별 플레이트에 대해 얻은 독립적인 K_d 값을 사용하여 FO를 계산합니다. 화합물의 농도에 대한 FO의 결과, 평균 및 표준 편차를 플로팅합니다.
      2. 0에서 1 사이의 값으로 FO를 보고하거나 0%-100% 범위의 값으로 백분율로 보고합니다.

Results

겔/필름에 고정된 I형 및 III형 콜라겐의 안정성 및 농도 평가
웰 당 고정화된 콜라겐 농도의 정량화는 세 가지 다른 조건을 사용하여 수행되었습니다: a) 단백질을 고정시킨 후 PBS로 세척하지 않고 웰에서(세척 없음); b) 코팅되지 않은 단백질을 제거하기 위해 고정화 후 세척 단계(PBS로 2회)가 있는 웰에서; c) 1 시간 동안 PBS로 배양 한 후 웰에서 (PBS 모방 실험). PBS incubation mimiking step은 실제 결합 분석 중 후보 화합물을 포함하는 용액으로 배양 후 콜라겐 겔/필름의 안정성을 이해하기 위해 수행되었습니다. 웰당 얼마나 많은 콜라겐이 고정되어 있는지 정량화하는 것은 특히 이러한 표적의 코팅 효율이 다른 경우 다른 표적에 대한 화합물의 결합 분율 및 해리 상수(K_d)를 정확하게 계산하고 비교하는 데 중요합니다. 도 7 은 III형 콜라겐에 대한 대표적인 안정성 분석을 보여주...

Discussion

이 연구는 I형 및 III형 콜라겐을 고정시키기 위한 재현 가능한 방법을 제시합니다. 또한 in vitro Eu(III) TRF 결합 데이터를 획득, 분석 및 해석하여 유형 I 및 III 콜라겐에 대한 후보 리간드의 결합 특성을 특성화하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에 제시된 I형 및 III형 콜라겐을 고정시키기 위한 프로토콜은 시험관 내 I형 및 III형 콜라겐 섬유형성에 대해 이전에 발표된 연구를 고려하여 개발 및 최적화되었습니다 ^13,16. 특히, 유형 I 및 III 콜라겐의 재현 가능한 코팅은 마이크로플레이트의 유형, pH, 온도 및 완충액의 이온 농도를 포함한 중요 조건을 최적화하여 달성되었습니다. 콜라겐은 pH 값과 온도가 증가함에 따라 자체 조립된다는 점을 감안할 때 콜라겐을 고정하기 위한 중화 및 도금 단계는 얼음 위에...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Gibco	14200075	물에 희석하여 1x PBS를 만드는 데 사용합니다 (1:10)
10x PBS	Gibco	14200075	이것을 사용하여 물에 희석하여 1x PBS를 만듭니다 (1:10)
2M HCL			집에서 제작되었으며 자세한 내용은 지원 문서에 있습니다.
2M HCL			사내에서 제작 및 세부 사항은 지원 문서에 있습니다
2M 수산화나트륨 +2M 글리신			집에서 만들고 자세한 내용은 지원 문서에 있습니다
2M 수산화나트륨 +2M 글리신			집에서 만들고 자세한 내용은 지원 문서에 있습니다
Cell-star 96 well  microplate	Greiner Bio-One	655 160
Cell-star 96 well  microplate	Greiner Bio-One	655 160
DELFIA enhacement solution	Perkin Elmer	1244-104
DELFIA enhacement solution	Perkin Elmer	1244-104
Ice
얼음
인피니트 200 PRO NanoQuant 마이크로플레이트 리더	TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant 마이크로플레이트 리더	TECAN
Non-binding (NBS) 96 웰 마이크로플레이트	Corning	3641
Non-binding (NBS) 96 웰 마이크로플레이트	Corning	3641
pH 전극 Inlab 루틴	메틀러 톨레도
pH 전극 Inlab 루틴	메틀러 톨레도
pH 측정기 (sevenCompact)	Mettler Toledo
pH 측정기 (sevenCompact)	Mettler Toledo
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermofisher	23227
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermofisher	23227
조직 배양 인큐베이터(37 ° C, 5% CO2)
Type I 소 콜라겐, 3 mg/mL	Corning	354231
Type III 인간 태반 콜라겐, 0.99 mg/mL	Advanced Biomatrix	5021