이 프로토콜은 손상된 PC12 세포를 치료하기 위해 두 허브의 조합 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 중국 전통 의학(TCM)의 최상의 적용 모드를 최적화하기 위한 참조를 제공합니다.
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방법 논문
손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략 탐색
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이 논문에서
요약
초록
뇌 허혈 치료에서 중국 전통 의학(TCM) 조합의 이점을 고려하여 손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략을 탐구하기 위해 제제 조합과 성분 조합 간의 효능 및 메커니즘의 차이를 연구했습니다. 글루코오스가 없는 배지와 결합된 염화코발트(CoCl2)를 사용하여PC12 세포의 산화적 손상을 유도하였다. 이어서, 황기몽홀리쿠 스(Ast)와 에리 게론 브레비스카푸 스(Eri) 주사제의 최적 조합을 선정하고, PC12 세포에 대한 안전하고 효과적인 농도를 스크리닝한 후 균일한 설계 방법에 따라 조합하였다. 또한, 스크리닝된 성분 조합은 2개의 허브에 10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린, 및 75μM 클로로겐산을 포함한다. 그런 다음 MTT, Annexin V-FITC / PI, 면역 형광 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 손상된 PC12 세포에서 제제 조합 및 성분 조합의 효능 및 메커니즘을 평가했습니다. 그 결과 세포 생존 촉진을 위한 최적의 제제 조합은 6:1.8(μM) 농도의 Ast 주사와 Eri 캡슐이었습니다. 성분 조합(10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린, 및 75μM 클로로겐산)이 제제 조합보다 더 효과적이었습니다. 두 조합 모두 세포 사멸 속도, 카스파제 -3의 형광 강도 및 세포 내 활성 산소 종 (ROS) 수준을 현저하게 감소시켰다. 한편, 그들은 p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax 및 Nrf2의 발현 수준을 상향 조절했다. 이러한 효과는 성분 조합에서 더 분명했습니다. 결론적으로, 두 조합 모두 PC12 세포 상의 무포도당 배지와 결합된CoCl2 에 의해 유도된 손상을 억제할 수 있고, 따라서 세포 생존을 촉진할 수 있다. 그러나, 제제 조합에 비해 성분 조합의 효율은 산화 스트레스 및 세포 사멸과 관련된 PI3K / Akt / Nrf2 신호 전달 경로의 더 강한 조절 때문일 수있다.
서론
뇌저관류로 인한 만성 뇌허혈은 중년 및 노인에게 흔한 질환입니다1. 장기 잠복성 허혈 질환으로서 진행성 또는 지속적인 신경 기능 장애로 이어질 수 있습니다. 주요 병리학 적 메커니즘에는 세포 사멸 및 산화 적 손상이 포함되며 진행성 또는 지속적인 신경 기능 장애를 유발합니다. 이것은 알츠하이머 병, 혈관성 치매 및 기타 질병의 병리학 적 기초이며 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다. 그러나 만성 뇌 허혈을 치료하기위한 현대 의학의 이상적인 약물은 여전히 부족합니다2. 동시에, 황기 몽홀리쿠 스(Ast)와 에리게론 브레비스카푸스 (Eri)의 조합은 중국 전통 의학(TCM)의 임상 실습에서 널리 사용되었습니다.4. 병용 전략은 뇌 허혈 후 신경 기능의 회복을 촉진하는 데 현저하게 개선되었으며, 이는 단일 약물보다 우수합니다. 그러나, 두 약물의 조합에서 투여 비율에는 큰 차이가 있습니다4. 효과적인 구성 요소와 작용 메커니즘이 잘 정의되어 있지 않아 임상 적용을 제한하는 핵심 문제입니다.
이전 연구는 쥐의 뇌 허혈 치료에서 Ast 주사와 E....
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프로토콜
1. 시약의 제조
- 125mL 멸균 배양 플라스크에 90mL의 DMEM 고당 배지, 10mL의 소 태아 혈청(FBS) 및 1mL의 페니실린-스트렙토마이신 용액을 추가하여 완전한 배지를 준비합니다. 전체 배지를 혼합하고, 폐쇄 조건 하에서 4°C에서 저장한다.
- DMEM 무설탕 배지 (완전히 용해 됨) 10mL에 0.02g의 CoCl2 분말 (정확하게 칭량)을 첨가하여 CoCl2 용액을 준비하여 8.4mM 원액을 얻습니다. 0.22μm 박테리아 필터로 용액을 여과하고 밀봉한 다음 빛으로부터 떨어진 4°C에서 보관합니다.
알림: CoCl2 는 불안정하므로 빛으로부터 보호되는 밀폐 용기에 보관해야합니다. CoCl2 용액의 유효 기간은 7 일이다. - 트리스-Hcl 완충염 용액 (TBST)을 준비하십시오.
- 8g의 염화나트륨, 0.2g의 염화칼륨 및 3g의 트리스 염기를 정확하게 측정합니다. 1L 비커에 넣은 다음 RO 물 1,000mL를 추가하여 혼합물을 녹입니다.
- pH를 7.4로 조정하고 트윈 20 1mL를 넣고 완전히 혼합하여 TBST 용액을 얻습니다.
참고: 트윈 20은 항원에 대한 항체의 비특이적....
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결과
Ast 주사와 Eri 캡슐의 최적 조합의 스크리닝은 그림 1에 나와 있습니다. 정상 PC12 세포에 대한 Ast 주사 및 Eri 캡슐의 세포 생존율은 도 1A에 나타내었다. 세포 생존율은 12 μM 이상의 농도에서 Ast 주사 (그림 1A) 및 5 μM 이상의 농도에서 Eri 캡슐 (그림 1A)에서 95 %보다 낮았으며, 이는 최대 무독성 농도가 각각 12 μM 및 5 μM임을 나타냅니다. 그들의 세포 독성은 단독으로 사용 된 아스트라갈로 사이드 A와 스쿠 텔라 린보다 컸다. CoCl2에 의해 유도 된 손상된 PC12 세포에 대한 Ast 주사 및 Eri 캡슐의 생존율은 그림 1B, C에 나와 있습니다. 모델 그룹과 .......
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토론
현대 임상 실습에서 뇌 허혈 치료를위한 이상적인 약물은 여전히 부족합니다2. 기를 보충하고 혈액 순환 방법을 활성화시키는 지침에 따라 Ast, Eri 및 기타 제제가 TCM의 임상 실습에서 병용되어 왔으며 우수한 종합 이점을 달성했습니다13,14,15. 많은 연구에 따르면 Ast는 혈액 뇌 장벽의 투과성을 향상시키고 뇌 혈류를 증가 시키며 신경 세포가 저산소증을 견디고 산소 자유 라디칼 손상에 저항하는 능력을 향상시키고 신경 기능 장애를 크게 개선 할 수 있습니다16,17. 노인성 허혈성 뇌혈관 질환16,17에 특.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 쓰촨성 과학기술부(2020YFS0325)의 주요 R&D 프로젝트에서 자금을 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1300 시리즈 클래스 II 생물안전 캐비닛 | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, | Inc-Akt | |
| Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | ||
| 분석 유세포 분석 | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC 세포사멸 검출 키트 | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| 황기 주사 | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast 주입 |
| Astragaloside A | 충칭 Gao Ren 생명 공학 회사 | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-IG | |
| BCA 단백질 정량 키트 | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| 이산화탄소 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| 클로로겐산 | 충칭 Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| 코발트 클로라이드 육수화물 | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 DMSO | |
| 인산수소이나트륨 도데카하이드레이트 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM 고당 매체 | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM 무설탕 매체 | Beijing Solarbio life sciences Company | ||
| ECL 발광 유체 | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| 전자 저울 | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., 상하이, 중국 | FA1204 | |
| 전기 영동 기기 | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | 에리 캡슐 |
| 소 태아 혈청 | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| 형광 현미경 | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| 젤 이미저 | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| 염소 항 마우스 2 차 항체 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| 염소 항토끼 2차 항체 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics 버전 26.0 | International Business Machines Corporation, USA-ImageJ | ||
| 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | 이미징 소프트웨어 |
| Immunol 형광 염색 키트 | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| 마커 | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| 마이크로플레이트 리더 | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | ||
| Motic 도립 현미경 | Nanda Scientific Instruments Co. | ||
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| 무지방 우유 | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-IG | |
| PC12 세포 | 중국과학원 | ||
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase 프로테아제 억제제 혼합물 | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| 인산이수소칼 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| 활성산소종 분석 키트 | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA 용해 솔루션 | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| 멸균 필터 팁(0.22 &마이크로; m) | 머크 바이오테크놀러지, Inc. | ||
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | 증권 시세 |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL& | |
| beta;-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-IG |
참고문헌
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert c....
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재인쇄 및 허가
