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방법 논문

생체 내에서 특발성 폐 섬유증에 미치는 영향을 연구하기 위해 IL-33 자극 대식세포를 블레오마이신 유도 마우스 모델로 입양 전달

3.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64742

⸱

2023년 5월 5일

 ,  , 
1Department of Basic Medicine, Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

정오 공지

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

요약

이 프로토콜은 특발성 폐 섬유증(IPF)의 생체 내 연구를 용이하게 할 수 있는 마우스 모델에서 폐포의 IL-33 자극 후 폐 간질 대식세포(IM)의 분리 및 입양 전달을 설명합니다.

초록

조기 폐 손상으로 인한 염증 반응은 특발성 폐 섬유증 (IPF) 발병의 중요한 원인 중 하나이며, 이는 대 식세포 및 호중구와 같은 염증 세포의 활성화뿐만 아니라 TNF-α, IL-1β 및 IL-6을 포함한 염증 인자의 방출을 동반합니다. IL-33 자극에 반응하여 활성화된 폐 간질성 대식세포(IM)에 의해 유발되는 초기 염증은 IPF의 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 프로토콜은 IPF 발달을 연구하기 위해 IL-33에 의해 자극된 IM을 마우스의 폐로 입양 전달하는 것을 설명합니다. 여기에는 숙주 마우스 폐에서 1차 IM을 분리 및 배양한 다음, 자극된 IM을 블레오마이신(BLM) 유도 IPF 수용자 마우스(이전에 클로드로네이트 리포솜으로 처리하여 폐포 대식세포가 고갈됨)의 폐포로 이식하는 것과 해당 마우스의 병리학적 평가가 포함됩니다. 대표적인 결과는 IL-33 자극 대식세포의 입양 전이가 마우스에서 폐 섬유증을 악화시킨다는 것을 보여주며, 이는 대식세포 입양 전이 실험의 확립이 IPF 병리를 연구하기 위한 좋은 기술적 수단임을 시사한다.

서론

특발성 폐섬유증(IPF)은 여러 요인에 의해 유발되는 미만성 폐염증성 질환이다1. Th1 및 Th2 면역 반응의 사이토카인 미세환경에서, 대식세포는 고전적으로 활성화된 대식세포(M1) 및 대안적으로 활성화된 대식세포(M2)로 분극화될 수 있다. 지질다당류(LPS) 또는 사이토카인 IFN-γ M1 대식세포가 분극화되도록 유도하고 iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α 및 IL-12를 포함하는 전염증성 사이토카인을 생성합니다. 대조적으로, II형 사이토카인 IL-4 및 IL-13은 폐 섬유증2를 촉진하는 TGF-β 및 PDGF와 같은 다양한 섬유아세포 성장 촉진 인자를 생성할 수 있는 M2 대식세포의 분극을 유도합니다. IPF의 병리학적 과정은 대식세포 활성화 및 침윤을 동반한다. IPF는 사이토카인의 방출을 통해 손상 복구, 염증 및 섬유증을 매개한다3. 제한된 치료 옵션만 사용할 수 있기 때문에 IPF의 분자 병리학적 메커니즘을 탐색하는 것은 IPF 예방 및 치료를 위한 새로운 전략을 개발하는 데 큰 의미가 있습니다. 우리 그룹과 다른 연구자들에 의한이전 연구4,5는 IPF 환자와 블레오마이신(BLM) 유도 IPF가 있는 마우스 모델에서 IL-33의 증가된 방출을 확인했습니다. IL-33은 섬유화 과정에서 상피세포와 내피세포에서 분비되어 대식세포 활성화에 관여하여 섬유아세포의 비정상적인 증식, 백혈구 침윤 및 궁극적인 폐 기능 상실을 초래한다5. 현재 프로토콜은 마우스 모델에서 IPF 발달을 연구하기 위한 수단으로서 IL-33 자극 간질 대식세포(IM)를 폐포로 입양 전달하는 것을 설명합니다. 여기서, 숙주 마우스의 폐 조직으로부터 IM을 분리하고, 시험관 내에서 배양하고, 24시간 동안 IL-33으로 자극한 다음, 기관 주사에 의해 수용자 마우스의 폐포로 입양적으로 옮겼다. 자극된 마우스 대식세포의 직접 수집과 수용자 폐포로의 입양 전달은 폐 섬유증의 정도를 악화시키는 것으로 밝혀졌으며 이전 연구에 비해 자극 인자의 섬유증 영향을 보다 명확하게 설명할 수 있다6. 이 논문에 기술된 기술은 연구자들이 IPF의 발달에서 잠재적인 사이토카인에 의해 자극된 대식세포의 기능을 탐구할 수 있게 한다.

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프로토콜

모든 실험은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행하였다. 모든 동물 실험은 Jiangnan University의 실험 동물 복지 윤리위원회의 승인을 받았습니다(JN No. 20211,130m1720615[501]).

참고: 총 10마리의 수컷 C57BL/6 마우스가 6-8주령이고 체중이 20-25g인 이 연구에 사용되었습니다. 연구의 3개 실험 그룹에는 각각 3마리의 수용 마우스가 포함되었고, 1마리의 숙주 마우스가 IM 분리에 사용되었습니다.

1. 마우스 폐 대 식세포의 고갈

  1. 30분 전에 냉장고에서 클로드로네이트 리포좀 바이알( 재료 표 참조)을 꺼내 실온으로 데우고 여러 번 뒤집어 균일한 혼합을 보장합니다.
    참고: 클로드로네이트 리포솜은 친수성 디클로로메틸렌 비스포스포네이트 분자를 캡슐화합니다. 이러한 리포좀이 대식세포에 의해 소비될 때, 클로드로네이트는 리소좀 포스파타제의 작용에 의해 서서히 방출되며, 그 축적은 결과적으로 세포 사멸과 대식세포의 고갈을 유발한다7.
  2. 3 % isoflurane으로 마우스를 마취하십시오. 의식을 확인하기 위해 한쪽 발을 꼬집어 마취 깊이를 확인합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 수의학 연고를 바르십시오.
  3. 멸균 흡입 팁이 있는 피펫을 사용하여 클로드로네이트 리포솜 60μL을 흡인합니다. 마취된 마우스의 비강 내로 약물을 적하하여 마우스가 흡입할 때 약물이 기관으로 흡입되도록 합니다. 한 방울 떨어 뜨린 후 마우스가 약물을 완전히 흡입하고 고르게 호흡하는지 확인하십시오. PBS 를 단독으로 포함하는 리포솜을 대조군으로 투여한다 8(그림 2).
  4. 마우스의 회복 속도를 높이기 위해 재가열을 위해 마우스를 38°C 항온 테이블에 놓습니다. 생쥐가 깨어날 때까지 모니터링하십시오. 생쥐가 잘 회복되고 흉골 기댄스를 달성 한 후 새장으로 옮깁니다.
  5. 클로드로네이트 리포좀으로 처리한 지 2일 후에 폐포 대식세포가 고갈된 마우스를 이식 실험을 위한 수용자 마우스로 사용하였다.
    참고: 본 연구에서는 클로드로네이트 리포좀을 흡입하여 투여한 후 앞서 설명한 8,9와 같이 대식세포 마커의 발현을 확인하여 폐포 대식세포의 고갈을 확인했습니다(보충 그림 1 참조).

2. IM의 격리와 문화

  1. 케타민(120mg/kg)과 자일라진(16mg/kg)을 복강내 주사하여 숙주 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사의 상실을 통해 마취의 깊이를 확인하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 수의학 연고를 바르십시오. 그런 다음 마취 된 마우스의 피부를 75 % 알코올과 요오드로 소독합니다. 가위를 사용하여 피부를 자르고 심폐 조직을 노출시킵니다
  2. 20G 바늘로 주사기에서 1x PBS 10mL를 흡인하고 바늘 끝을 마우스의 우심방에 삽입합니다(그림 3A). 수술용 가위로 마우스의 하대정맥을 절단한 다음 폐 조직이 하얗게 변할 때까지 일정한 속도(10-20mL/분)로 PBS로 마우스를 수동으로 관류합니다. 폐 조직을 절제하고 배양 접시에 담긴 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다(그림 3B).
  3. 폐 조직을 약 2 mm x 2 mm x 2 mm의 조각으로 자릅니다. 그런 다음 1% 콜라게나제 A를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 15mL를 폐 조직에 추가하여 대식세포를 분리합니다. 37°C 진탕 테이블에서 30분 동안 100rpm으로 배양합니다.
  4. 폐 조직 현탁액을 10mL 주사기를 통해 최소 20배 흡인하여 가능한 한 미세하게 만듭니다. 이 현탁액을 40μm 세포 여과기를 통해 여과합니다. 여과액을 400 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
  5. 얼음 위에 3mL의 RBC 용해 완충액( 재료 표 참조)을 2-3분 동안 첨가하여 펠릿의 적혈구를 용해합니다.
  6. 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 10mL의 DMEM(100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신 함유)으로 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
  7. 세포를 2 x 107 세포/접시에서 10cm 부착 세포 배양 접시에 시드하고 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 배양합니다. 이렇게 하면 폐 IM이 접시에 부착될 수 있습니다(5). 1시간 후, 상청액과 부유 세포를 흡인하고 10mL의 신선한 완전 배양 배지(10% FBS, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유한 DMEM)를 추가합니다. 8시간 이상 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
  8. 앞서 설명한 바와 같이 F4/80 및 CD11c 마커에 대한 염색과 함께 유세포 분석을 사용하여 얻은 IM의 순도를 결정합니다5 ( 보충 그림 1 참조).

3. IM을 폐포로의 입양 이식

  1. 분리된 폐 IM이 포함된 플레이트(단계 2.7)의 배양 배지를 IM을 자극하기 위한 10ng/mL IL-33이 포함된 완전한 배양 배지로 교체합니다. 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 대조군으로 IL-33 대신 PBS 1개를 사용합니다.
  2. 폐 IM을 1mL의 0.25% 트립신으로 5분 동안 처리하여 해리합니다. 이어서, 3 mL의 신선한 배양 완전 배지를 첨가하여 소화를 켄칭하고, 세포 현탁액을 150 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 폐 대식세포를 수확한다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 PBS에서 세포를 5 x 105 cells/50 μL의 최종 농도로 재현탁합니다.
  3. 수용자 마우스를 3% 이소플루란 가스로 마취합니다. 마우스가 의식을 잃을 때까지 기다린 다음 (1.2 단계에서와 같이) 마취 된 마우스의 팔다리를 의료용 테이프로 수직 플레이트에 고정합니다. 면봉을 사용하여 마우스의 혀를 한쪽으로 부드럽게 당깁니다.
  4. 삽관 램프를 켜고 기관을 볼 수 있도록 마우스의 목구멍에 비추십시오. 기관이 혀 밑 부분에 가깝고 식도가 목 뒤쪽에 있지만 수술 중에 식도 입구가 보이지 않는지 확인하십시오.
  5. 삽관 사용 lamp (22 G) 마우스의 삽관을 돕습니다. 유치 바늘 캐뉼라를 가이드 와이어(직경 0.4mm)로 기관으로 안내합니다. 가이드 와이어를 제거하고 캐뉼라를 마우스 기관에 밀어 넣어 삽관을 완료합니다.
  6. 캐뉼라가 기관으로 들어가는 것을 관찰한 후 50μL의 세포 현탁액(5 x 105 IM 포함)을 기관을 통해 수용자 마우스에 주입합니다.
  7. 회복 속도를 높이기 위해 재가열을 위해 마우스를 38°C 일정한 온난화 패드에 놓습니다. 생쥐가 깨어날 때까지 모니터링하십시오. 그들이 잘 회복하고 흉골 기댄스를 달성 한 후, 새장으로 옮깁니다.
  8. 24시간 후, IPF를 유도하기 위해 1.4U/kg 체중의 용량으로 기관을 통해 블레오마이신(BLM)을 투여합니다(3.3-3.5단계의 절차 사용). 대조군에 동일한 양의 식염수를 투여하십시오.
  9. 21일 후, PBS 또는 IL-33 자극 IM 현탁액으로 입양된 여러 그룹의 마우스에 대한 폐섬유증의 중증도 정도를 확인하여 섬유증에 대한 마커의 발현을 평가하여 Ashcroft 점수를10으로 확인하였다.
    1. RNA 추출 시약을 사용하여 폐 조직에서 전체 RNA를 추출합니다( 재료 표 참조).
      참고: 정량 분석은 마이크로플레이트 리더로 수행되었습니다. OD260/OD280 비율이 1.8-2.0이면 RNA 순도가 높습니다. 모든 샘플을 -80 °C에서 저장하였다.
    2. 형광 정량 PCR을 수행하여 특정 프라이머를 사용하여 α-평활근 액틴(SMA) 및 피브로넥틴의 발현을 평가합니다.
      참고: α-SMA에 사용된 프라이머는 정방향 5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' 및 역방향 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3'이었고, 피브로넥틴에 사용된 프라이머는 정방향 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' 및 역방향 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'이었다.
  10. 아래에 설명된 대로 면역조직화학을 수행합니다.
    1. 왼쪽 폐를 탈수하고 내장한 후 파라핀 슬라이서로 4μm 두께로 자릅니다.
    2. 조직 섹션을 슬라이드에 놓고 슬라이드를 65-70 ° C의 오븐에서 30 분에서 1 시간 동안 굽습니다. 알코올 함량이 감소하는 비율(즉, 알코올 100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 알코올)로 슬라이드를 5분 동안 탈랍합니다.
    3. 슬라이드를 헤마톡실린 염료 용액(분석적으로 순수함)에 5분 동안 염색합니다. 그런 다음 슬라이드를 수돗물로 씻으십시오. 슬라이드를 1% 염산 알코올에 3초 동안 담그고 떠 있는 색을 씻어낸 다음 흐르는 물에 5분 동안 담급니다. 섹션이 파란색으로 바뀝니다.
    4. 에오신 용액에 10초에서 1분 동안 담그고(색상에 따라 염색 시간 결정) 수돗물로 씻고 70%, 80%, 95%, 100%, 100% 알코올에 각각 5분씩 넣습니다. 그런 다음 슬라이드를 크실렌 I 및 자일렌 II 용액에 3분 동안 놓습니다. 건조 후 중성 접착 밀봉 필름으로 수직 현미경으로 관찰하고 사진을 찍습니다.
    5. 폐 섬유증의 중증도를 나타내기 위해 섹션에서 Ashcroft 점수를 매기십시오10. 두 개의 독립 표본에 대한 t-검정을 사용하여 데이터의 통계 분석을 수행합니다.

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결과

여기에 사용된 프로토콜은 그림 1의 순서도에 요약되어 있습니다. 코를 통한 클로드로네이트 리포솜의 흡입(그림 2)은 성인 C57BL/6 마우스의 폐 대식세포를 고갈시키는 데 사용되었으며, 이는 좋은 수용자 마우스 모델을 생성했습니다. 폐 IM은 처리되지 않은 다른 (숙주) 마우스(그림 3A, B)에서 분리되어 시험관 내에서 배양되었습니다. 분리된 대식세포를 IL-33으로 24시간 동안 자극한 다음, 자극되지 않은 대식세포를 대조군으로 사용하여 수용자 마우스에 기관 내 주입했습니다(그림 3C). 24시간 후, BLM을 수용자 마우스에 투여하여 폐 섬유증 모델을 유도하였다. IL-33 자극 유무에 관계없이 IM의 입양 전달 후 폐 섬유증의 정도를 BLM 투여 후 21일에 비...

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토론

이 연구는 생쥐의 폐 섬유증 메커니즘을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 대식세포를 고갈, 분리, 배양 및 전달하는 효과적인 방법을 제공합니다. 마우스 대식세포 고갈을 위한 많은 방법들이 있는데, 기관투여(tracheal administration), 꼬리 정맥 주사(tail vein injection), 비강 흡입(nasal inhalation)과 같다11. 이 연구는 작동이 간단하고 폐 대식세포를 효과적으로 고갈시킬 수 있는 비강 흡입 방법을 최적화했습니다 8,9. 24시간 동안 배양에서 IM의 IL-33 자극 후, IM을 비침습적 기관 투여 경로를 사용하여 수용자 마우스의 폐로 입양 이식하여 마우스에 대한 외상을 최소화했습니다. 삽관 중 삽관의 원활한 진행을 보장하기 위해 >20분의 마취 기간을 사용하여 생쥐의 생존율을 크게 향상시켰습니다. 50 μL IM 현탁액의 초기 기관 투...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.

감사의 글

저자는 Jiangnan University의 실험실 관리 특별 주제: 병리학적 표본을 기반으로 한 디지털 슬라이스 라이브러리 구축(JDSYS202223)과 중국 국립 자연 과학 재단(81800065)을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
  DMEMLife technologies Biotechnology, 미국1508012
동맥 내주 바늘B Braun Melsingen AG, 독일21G15G8393
BD  아큐리  C6 PlusBecton Dickinson, 미국
BleomycinBiotang, 미국Ab9465
이산화탄소 인큐베이터Thermo Forma, 미국Thermo Forma370
CD11bR& D 시스템, 미국1124F
CD11cR & D 시스템, 미국N418
세포 배양 접시Thermo Forma, 미국174926
Clodronate 리포솜 클로드로네이트 리포솜, 네덜란드CI-150-150
콜라겐 분해 효소 A시그마 - 알드리치, 미국10103578001
F4 / 80R & D Systems, 미국521204
Falcon Cell StrainerBecton, Dickinson and Company, USA352340
Fetal bovine serum (FBS)Life technologies, USA1047571
Hematoxylin Eosin Nanjing Jiancheng Technology, China06-570
LightCycler 480 PCR 검출 시스템Roche, 미국
쥐 재조합 인자 IL-33Peprotech, 미국210-33
Nikon 현미경Nikon Corporation, 일본941185
페니실린, 스트렙토마이신Life Technologies, 미국877113
인산염 완충기 (PBS)광동 Huankai 미생물 기술, 중국1535882
RBC 용해 완충액Beyotime 생명 공학 회사, 중국C3702
RNA IsolaterVazyme 회사, 중국R401-01-AA총 RNA 추출 시약
RWD 흡입 마취 기계심천 Rayward Life Technology, 중국R500
반자동 파라핀 슬라이서Leica, 독일LeicaRM2245
SYBR Premix Ex TaqTakara, 일본410800
Trypsin 0.25%Life Technologies, 미국1627172

참고문헌

  1. Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
  2. Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
  3. Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897(2021).
  4. Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
  5. Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
  6. Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
  7. Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
  8. He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846(2017).
  9. Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
  10. Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
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  12. Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
  13. Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
  14. Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.

Step 2.1 of the Protocol was updated from:

Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

to:

Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

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IL 33Ashcroft
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