체외 히알루로난이 풍부한 세포외 기질이 신경 능선 세포 이동에 미치는 영향에 대한 조사

요약

이 프로토콜은 신경 능선 세포가 히알루로난이 풍부한 세포외 기질로의 생체 내 이동에 관여하는 분자의 기능 분석에 적합한 시험관 내 이동 실험을 설명합니다.

초록

신경능선세포(NCC)는 신경관의 등쪽 영역에서 유래하는 이동성이 높은 세포입니다. 신경관에서 NCC를 이동하는 것은 NCC 생산 및 표적 부위로의 후속 이동을 위한 필수 과정입니다. 주변 신경관 조직을 포함한 NCC의 이동 경로에는 히알루론산(HA)이 풍부한 세포외 기질이 포함됩니다. 신경관에서 이러한 HA가 풍부한 주변 조직으로의 NCC 이동을 모델링하기 위해 HA(평균 분자량: 1,200-1,400kDa)와 콜라겐 유형 I(Col1)로 구성된 혼합 기질 이동 분석이 이 연구에서 확립되었습니다. 이 이동 분석은 NCC 세포주인 O9-1 세포가 혼합 기질에서 고도로 이동하며 HA 코팅이 이동 과정에서 국소 접착 부위에서 분해됨을 보여줍니다. 이 시험관 내 모델은 NCC 마이그레이션과 관련된 기계적 기반에 대한 추가 탐색에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 NCC 이동을 연구하기 위해 스캐폴드로 다양한 기질을 평가하는 데에도 적용할 수 있습니다.

서론

신경 능선 세포(NCC)는 발달 중인 배아에 존재하는 다능성 세포 집단이며 신경 형성 동안 신경판 경계에서 유래합니다. 그들은 말초 신경계, 심혈관계, 두개 안면 조직 및 골격을 포함한 다양한 조직의 형성에 기여합니다¹. 신경판 경계에서 유도 및 NCC 사양 후, NCC는 신경 상피에서 이동하여 NCC 유래 조직 부위로 이동합니다¹.

히알루론산(HA)은 세포외 기질(ECM)의 구성 요소로서 다양한 조직에 분포하는 비황산화 글리코사미노글리칸입니다. 배아 발달에서 HA의 중요성은 히알루론산 대사를 담당하는 유전자의 절제를 통해 모델 시스템에서 입증되었습니다. 예를 들어, 제노푸스(Xenopus)의 히알루론산 합성효소 유전자(Has1 및 Has2)의 돌연변이는 NCC 이동 결함과 두개안면 기형을 유발하는 것으로 밝혀졌다². 또한, HA 결합 프로테오글리칸인 아그레칸(aggrecan)과 베르시칸(versican)은 NCC 이동에 대한 억제 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다³. 마우스에서 Has2 절제는 심내막 쿠션 형....

프로토콜

모든 시술은 오사카 대학 치과 대학원 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 마우스 두개골 신경 능선 세포의 배양

참고: 이 연구에 사용된 신경 능선 세포주는 원래 Wnt1-Cre에서 파생된 O9-1 세포로 구성됩니다. E8.5 마우스 배아에서 분리된 R26R-GFP 발현 세포¹² (논의 참조). O9-1 세포를 배양하기 위해 여기에 설명된 방법은 이전에 확립된 프로토콜¹³을 따른다.

1. 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비합니다.
   1. 기저막 매트릭스( 재료 표 참조)를 얼음 위에서 해동합니다. 식힌 1x PBS에 매트릭스 1:50을 희석하고 얼음에 보관하십시오.
   2. 10cm 배양 플레이트에 희석된 기저막 매트릭스 용액 10mL를 코팅합니다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하고 사용하기 전에 매트릭스를 흡인합니다.
   3. 플레이트를 2mL의 PBS로 3배 세척합니다.
2. O9-1 세포를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에서 배....

결과

여기에 기술된 프로토콜을 사용하여 Col1 및 고분자량 HA(평균 분자량: 1,200-1,400 kDa)로 구성된 혼합 기질 상에서 이동 분석을 수행하였다. 갭의 경계에 있는 O9-1 세포는 HA가 풍부한 갭으로 쉽게 이동하는 것으로 나타났습니다(그림 4). FA 마커인 빈쿨린¹⁴에 대한 면역염색을 통해 O9-1 세포가 HA 분해 부위에서 국소 유착(FA)을 형성했음을 확인했습니다(그림 5).

그림 1: NCC에서의 TMEM2 발현.

토론

다양한 ECM 구성 요소가 NCC 마이그레이션/마이그레이션을 규제합니다. 예를 들어, HA는 NCC 마이그레이션 ^2,15를 긍정적으로 규제합니다. 흥미롭게도, 세포 표면 히알루로니다아제인 Tmem2의 유전자 마우스 모델을 기반으로 한 연구는 NCC 이동에서 HA 분해의 필요성을 설명했다⁹. 콜라겐은 또한 신경관을 둘러싸고 있는 ECM에 풍부하다⁽¹⁶). 류신이 풍부한 작은 프로테오글리칸인 데코린(Decorin)은 신경 발달 과정에서 NCC 이동을 조절하는 것으로 나타났다¹⁷. 라미닌(laminin)과 피브로넥틴(fibronectin)을 포함한 다른 ECM 성분은 NCC 접착 및 이동에 영향을 미친다¹⁸. 그러나 NCC 마이그레이션에서 ECM 구성 요소의 특.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 세포 배양 접시	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. 아니요. BSS-1005-B
2웰 배양 인서트	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555 라벨이 붙은 염소 안티-마우스 IgG	Invitrogen	Cat. A21422	염소 유래 항-마우스 2차 항체
자동 세포 계수기	Bio-Rad	Cat. 아니요. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	세포 동결 매체
콜라겐 유형 I	시그마	Cat. 제 08-115
완전 ES 셀 매체	Millipore	Cat. 아니요. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco' s 수정된 독수리 미디엄	Gibco	Cat. 11971025
소 태아 세럼	Gibco	Cat. 10270106
형광 현미경	Keyence	Cat. 아니요. BZ-X700
형광 라벨 HA	PG Research	FAHA-H2
유리 바닥 접시	Iwaki	Cat. 11-0602
글루 타르데히드	시그마	Cat. 번호 G5882
Matrigel	Fisher	Cat. 아니요. CB-40234	기저막 매트릭스
단클론 항빈쿨린 항체	Sigma	Cat. 아니요. V9264
마운팅 미디어	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. 아니요. SCC049
파라포름알데히드	시그마	Cat. 158127
트리에톡시실란	시그마	Cat. No. 390143
트립신-EDTA	밀리포어	고양이. 아니요. SM-2003-C