여기에서는 생체 내에서 마우스 태반의 중요한 발달 경로를 효과적으로 조작하는 시간별 방법을 설명합니다. 이것은 배아 12.5일째에 임신한 댐의 태반에 CRISPR 플라스미드를 주입하고 전기천공하여 수행됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
태반은 자궁 내 포유류의 발달을 조절하고 유지하는 필수 기관입니다. 태반은 산모와 태아 사이의 영양분과 노폐물의 전달, 성장 인자와 호르몬의 생산 및 전달을 담당합니다. 생쥐의 태반 유전자 조작은 태아 발달에서 태반의 특정 역할을 이해하는 데 중요합니다. 태반 특이적 Cre 발현 형질전환 마우스는 다양한 효과를 가지며 태반 유전자 조작을 위한 다른 방법이 유용한 대안이 될 수 있습니다. 이 논문은 표적 유전자의 발현을 수정하는 데 사용할 수 있는 CRISPR 유전자 조작을 사용하여 태반 유전자 발현을 직접 변경하는 기술을 설명합니다. 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 임신한 댐은 배아 12.5일(E12.5)에 개복술을 받고 CRISPR 플라스미드는 유리 마이크로피펫을 통해 개별 태반으로 전달됩니다. 플라스미드는 각 주입 후 즉시 전기천공됩니다. 댐 복구 후 태반과 배아는 나중에 평가될 때까지 계속 발달할 수 있습니다. 이 기술을 사용한 후 태반과 자손을 평가하면 발달에서 시간별 태반 기능의 역할을 결정할 수 있습니다. 이러한 유형의 조작을 통해 태반 유전학 및 기능이 여러 질병 상황에서 태아의 성장과 발달에 어떤 영향을 미치는지 더 잘 이해할 수 있습니다.
서론
태반은 태아 발달에 관여하는 필수 기관입니다. 태반의 주요 역할은 필수 요소를 제공하고 태아와의 영양분과 노폐물의 이동을 조절하는 것입니다. 포유류의 태반은 태아와 모체의 조직으로 구성되어 있으며, 태아와 모체의 경계면을 이루고 있으며, 따라서 산모와 태아의 유전적 영향이 기능에 영향을 미친다1. 태반의 유전적 기형이나 기능 장애는 태아 발달을 크게 변화시킬 수 있습니다. 이전 연구에서는 태반 유전학 및 발달이 태아의 특정 장기 시스템의 변화된 발달과 관련이 있음을 보여주었습니다. 특히, 태반의 이상은 태아의 뇌, 심장 및 혈관계의 변화와 관련이 있다 2,3,4,5.
호르몬, 성장 인자 및 기타 분자를 태반에서 태아로 운반하는 것은 태아 발달에 중요한 역할을 한다6. 특정 분자의 태반 생산을 변경하면 신경 발달이 바뀔 수 있음이 밝혀졌습니다. 산모의 염증은 태반에서 트립토판(TRP) 대사 유전자 발현을 변화시켜 세로토닌 생성을 증가....
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프로토콜
모든 절차는 연방 규정 및 아이오와 대학 정책에 따라 수행되었으며 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물과 축산
- 동물에게 음식과 물을 임의로 12시간 일광 주기로 유지하십시오.
- 생후 8-15주령의 CD-1 암컷 마우스를 사용한다. E0.5를 식별하기 위해 교합 플러그가 있는지 확인하십시오.
- E0.5에서 임신한 댐을 단독으로 수용합니다.
2. 마이크로피펫의 교정
알림: 마이크로피펫의 보정은 가능하면 수술 전에 수행해야 합니다.
- 마이크로피펫을 만들고 보정하기 전에 모든 플라스미드를 DNase가 없는 물에서 권장 농도(0.1μg/μL)로 희석합니다. 플라스미드를 적절하게 희석된 Fast Green 염료(PBS에서 1μg/μL)(최종 플라스미드 농도: 0.06μg/μL)와 혼합합니다.
- 마이크로피펫 풀러로 외경 1.5mm, 내경 0.86mm의 10cm 유리 모세관을 사용하여 마이크로피펫을 당깁니다.
- 멸균 집게로 마이크로 피펫 (2-3 m....
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결과
일반 절차 결과(그림 6)
이 연구에는 세 가지 조작 된 그룹이있었습니다. 여기에는 일반적인 CRISPR Cas9 대조군 플라스미드(Cas9 Control), 활성화 대조군 CRISPR 플라스미드(Act Control) 또는 IGF-1 SAM 활성화 플라스미드(Igf1-OE)가 주입된 태반이 포함되었습니다. Cas9 Control은 knockout 플라스미드에 더 적합하며, activation control은 과발현/활성화 플라스미드에 더 적합합니다. 주입 및 전기천공을 통해 태반을 조작함으로써 발생하는 생존력 변화를 평가하기 위해, 깔짚 내의 배아 생존을 E14.5에서 분석하였다(도 6A). 이 시점은 전기천공을 사용하여 CRISPR 플라스미드의 생체 내 삽입을 수행한 다른 연구에서 발현 변화가 8-22시간 .......
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토론
태반은 태아 성장의 일차적 조절인자이며, 앞서 언급했듯이 태반 유전자 발현 또는 기능의 변화는 태아 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있다6. 여기에 설명된 프로토콜은 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 마우스 태반의 표적 생체 내 CRISPR 조작을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 추가 연구에 사용할 수 있는 생존 가능한 배아와 해당 태반의 상당한 수확량을 허용합니다(그림 6A, B). 이 기술을 통해 E14.5에서 태반 IGF-1을 성공적으로 과발현할 수 있었습니다(그림 7A,B). 사용된 플라스미드는 삽입된 플라스미드가 조작된 태반에 남아 있고 처리되지 않은 인접한 태반에는 존재하지 않았기 때문에 특이성을 나타냈습니다(그림 7C,D
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 R01 MH122435, NIH T32GM008629 및 NIH T32GM145441과 같은 자금 출처를 인정합니다. 저자는 수술실과 장비를 사용한 아이오와 대학의 Val Sheffield 박사와 Calvin Carter 박사의 연구실, 현미경 검사에 도움을 준 Eric Van Otterloo 박사, Nandakumar Narayanan 박사, Matthew Weber 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 파일럿 수술에 도움을 준 Sara Maurer 박사, Maya Evans 및 Sreelekha Kundu에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5ml 튜브 | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| Thermo Fisher Scientific | 의 4% 파라포름멜드히드(PFA). | AP | |
| 96 웰 플레이트 | Cornings | 3598 | BCA 키트 |
| 흡수제 언더 패드 | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| 활성화 제어 플라스미드 | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-437275 | 희석을 위해 제공되는 Dnase-free 물 |
| AMV 역 전사 효소 | New England Biolabs | M0277L | cDNA 합성 |
| 마취제에 사용 가스 기화기 | Vetamac | VAD-601TT | VAD-소형 기화기 |
| 인공 눈물 젤 | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | 단백질 정량화 |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | 휴대용 조직 균질화 장치 |
| CellSens 소프트웨어 | Olympus | V4.1.1 | FISH 이미지로 이미지 처리. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | 사용 전 살균 |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | 희석을 위해 제공되는 Dnase-free water |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| 해부 현미경 | Leica | M125 C | 괴사 후 이미징에 사용 |
| 용해성 봉합 | Med Vet International | J385H | |
| 증류수 | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) 칼슘; (-) 마그네슘 |
| ECM 830 전기 Electroporator (Electroporation 기계) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | 발전기 전용 |
| 전기 면도 | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation 패들 / Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3mm 직경 패들; 와이어 포함 |
| 임베딩 카세트 : 250 PK | Grainger | 21RK94 | 태반 임베딩 카세트 |
| 에탄올 | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air 캐니스터 | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | 과잉 이소플루란 필터 |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | 1 μ g/ml 및 필터; 빛으로부터 보호 |
| 필터 기반 마이크로플레이트 광도계(플레이트 리더) | Fisher Scientific | 14377576 | BCA 및 ELISA 겸자에 사용할 수 있습니다 |
| VWR | 82027-386 | 미세 팁, 직선, 톱니 모양의 | |
| 포르말린 용액, 중성 완충, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
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| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | 희석을 위한 무DNA 물 |
| 유도 챔버 | Vetamac | 941443 | 특정 리터 크기 필요 없음 |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA 분리 |
| 케타민 HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | 시그마 Aldrich | 63069-100ML | 1M. 단백질 균질화 완충액 |
| MicroAmp™ 바코드가 있는 광학 384웰 반응 플레이트 | Fisher Scientific | 4309849 | 바코드 플레이트 필요 없음 |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | BTX Microinjector Microinjector BTX |
| Harvard Apparatus | 45-0766 | 스테인리스 스틸 피펫 홀더, 길이 130 mm, 1 - 1.5 mm 피펫용 | |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Appliances | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus 시스템 |
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| 마이크로 플레이트 믹서 (플레이트 셰이커) | scilogex | 822000049999 | |
| 마우스 / 쥐 IGF-I / IGF-1 Quantikine ELISA 키트 | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| 질소 탱크 | Linde | 7727-37-9 | 모든 내부 가스 |
| 비스테로이드성 항염증제(NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| 오팔 620 검출 염료 | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | FISH |
| 최적 절단 온도(O.C.T) 화합물 | Sakura | 4583 | |
| 산소 탱크 | Linde | 7782 - 44 - 7 | 의료용 산소 |
| 유봉 | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| 포비돈-요오드 용액, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| 전원 SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 qPCR | |
| 랜덤 헥사머에 사용(랜덤 프라이머) | New England Biolabs | S1330S | cDNA 합성에 사용 |
| 면도날 | Grainger | 26X080 | |
| RNA 클린업 키트 및 Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | 형광 in situ hybridization에 필요한 모든 시약이 포함되어 있습니다. 프로브는 별도로 판매됩니다. |
| RNAscope™ 프로브- Mm-PRL8A8-C2 | 고급 셀 진단 | 528641-C2 | |
| RNAscope™ 프로브- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | 고급 셀 진단 | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | 현장 교잡용 드라이 오븐 |
| 위 | VWR | 82027-578 | 해부 가위, 날카로운 팁, 4¹/? |
| 염화나트륨 (식염수) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | 멸균, 0.9% |
| 시트르산나트륨, 삼나트륨염, 이수화물, [구연산, 삼수산나트륨] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| 수산화나트륨 1N 농축액, 피셔 케미컬 | 피셔 사이언티픽 | SS277 | 단백질 균질화 완충액 |
| 스티머 | 벨라 | B00DPX8UBA | |
| 멸균 수술용 드레이프 | 버스 | 696 | 사용 전 멸균 |
| Superfrost Plus 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath 커버 유리 24x60 | Leica | 3800160 | |
| 주사기 | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip 주사기 멸균, 일회용, 1 mL |
| 써모 사이언티픽&트레이드; Invitrogen™ 나노드롭&트레이드; WiFi 및 Qubit&trade가 있는 1개의 분광 광도계; 4 형광측정기 | Fisher Scientific | 13-400-525 | 이 구성은 Qubit 4 형광측정기와 함께 제공됩니다. 큐비트 수량화가 필요하지 않습니다. |
| 조직 접착제 | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. 단백질 균질화 완충액 |
| TRIzol™ 시약 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 RNA 분리 | |
| TSA 버퍼 팩 | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Opal 620 검출 염료를 희석하는 데 사용 |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | 기화기 및 기화기 액세서리에 부착 |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | FISH 이미징 |
| 에 사용DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip 마운팅 미디어 |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well | Block Thermo Fisher Scientific | 4453536 | 이것은 SYBR 384-웰 블록 검출을 위한 것입니다. TaqMan 및/또는 더 작은 블록 사용 |
| 가능 Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
참고문헌
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- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
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