후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
수초화 과정은 신경계에서 빠르고 충분한 신호 전달을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 말초 신경계에서 뉴런과 슈반 세포는 축삭의 수초화를 제어하기 위해 복잡한 상호 작용에 관여합니다. 이러한 상호 작용의 교란과 수초의 파괴는 염증성 신경병증의 특징이며 신경퇴행성 장애에서 이차적으로 발생합니다. 여기에서 우리는 말초 신경계의 수초화 과정을 조사하고, 축삭-슈반 세포 상호 작용을 연구하고, 각 세포 유형에 대한 치료제의 잠재적 효과를 개별적으로 평가하기 위해 말초 축삭의 강력한 수초화를 개발하는 후근 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 제시합니다. 방법론적으로, 배아 쥐(E13.5)의 등쪽 뿌리 신경절을 수확하고, 주변 조직으로부터 해리시키고, 3일 동안 전체 외식편으로 배양하였다. 슈반 세포는 3 주령의 성인 쥐로부터 분리되었고, 좌골 신경은 효소에 의해 소화되었다. 생성된 슈반 세포는 자기 활성화 세포 분류에 의해 정제되고 뉴레귤린 및 포스콜린이 풍부한 조건 하에서 배양되었습니다. 후근 신경절 외식편 배양 3일 후, 30,000개의 슈반 세포를 아스코르브산을 함유하는 배지에서 하나의 후근 신경절 외식편에 첨가했습니다. 수초화의 첫 징후는 면역세포화학적 염색에서 미엘린 염기성 단백질에 대한 산란 신호를 통해 공동 배양 10일째에 검출되었습니다. 14일째부터 수초가 형성되어 축삭을 따라 전파되었습니다. 수초화는 축삭 밀도의 차이를 설명하기 위해 수초화 면적과 축삭 면적의 비율로 미엘린 염기성 단백질 염색으로 정량화할 수 있습니다. 이 모델은 시험관 내에서 말초 수초화의 다양한 측면을 연구할 수 있는 실험 기회를 제공하며, 이는 말초 신경계의 염증 및 신경퇴행성 질환에서 탈수초화 및 신경변성의 병리와 가능한 치료 기회를 이해하는 데 중요합니다.
서론
말초 신경계(PNS)에서 빠른 정보 전달은 미엘린으로 둘러싸인 축삭에 의해 매개됩니다. 축삭의 수초화는 전기 자극의 빠른 전파를 가능하게 하는 데 필수적인데, 이는 신경 섬유의 전도 속도가 축삭 직경 및 미엘린 두께와 상관관계가 있기 때문입니다1. 말초에서 중추신경계(CNS)로의 감각 신호 전달은 후근 신경절(DRG)이라고 하는 후근의 확대에 존재하는 1차 감각 뉴런의 활성화에 의존합니다. 미엘린의 형성과 유지를 위해, PNS의 수초화 신경교세포인 축삭과 슈반 세포 사이의 지속적인 소통은 필수적이다2.
PNS의 많은 질병은 일차 축삭 또는 탈수초 손상에 의한 정보 전달을 방해하여 감각 이상 또는 감각 이상을 유발합니다. 1차 감각 뉴런은 뉴런 손상 후 뉴런과 주변 슈반 세포 사이의 복잡한 상호작용에 의해 어느 정도 재생될 수 있는 능력을 가지고 있다3. 이 경우, 슈반 세포는 세포 재프로그래밍을 통해 축삭 및 미엘린 파편을 제거하고 축삭 재생을 촉진하여 재수초화를 일으킬 수 있다4. PNS의 탈수초성 장애에 대한 가능한 치료 옵션을 찾기 위해서는 건강과 질병에서 수초화의 메....
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프로토콜
모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 공동체 협의회 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 슈반 세포 배양
- Schwann 세포 배양용 코팅
- 무균 상태에서 세포 배양 접시를 코팅합니다. 0.01% 폴리-L-라이신(PLL) 2mL를 각각 2개의 60mm 조직 배양(TC) 접시에 바르고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- PLL을 제거하고 TC 접시를 증류수로 2배 세척한 다음 4°C에서 밤새 1μg/cm2 라미닌 2mL와 함께 배양합니다. TC 접시를 아쿠아 데스트로 2번 씻고 접시를 자연 건조시킵니다.
- Schwann 세포 배양을 위한 배지 준비
- 멸균 조건에서 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)/F-12(고포도당)에 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS), 2μM 포스콜린, 10nM 뉴레굴린 및 50μg/mL 겐타마이신을 추가하여 50mL의 Schwann 세포 배지를 준비합니다.
- 멸균 조건에서 70μg/mL 겐타마이신으로 Leibovitz의 L-15 배지 50mL를 준비합니다.
- 좌골 신경 준비....
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결과
공동 배양의 수초화는 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 및 20일에 평가되었습니다. DRG 외식편 및 Schwann 세포를 MBP, βIII-튜불린 및 DAPI에 대해 염색하였다. 공동 배양의 축삭 네트워크는 밀도가 높았고 관찰 시간 경과에 따라 눈에 띄게 변하지 않았습니다. 작은 파편 형태의 미엘린의 첫 징후는 10 일째에 검출 가능했고 12 일째에 증가했다 (그림 2). MBP 양성 영역은 배양 20일까지 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 수초화는 MBP 및 βIII-튜불린 양성 영역의 비율로 정량화되었습니다. 수초화는 10일에 비해 18일과 20일에 유의하게 증가했다(그림 3; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001).
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토론
여기에서 우리는 두 개의 개별 세포 유형 배양인 Schwann 세포와 후근 신경절 외식편을 병합하여 시험관 내 수초화 생성을 위한 빠르고 쉬운 프로토콜을 제시합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 특히 배양 첫날에 DRG 외식편을 재배하는 것입니다. DRG는 강력한 축삭 네트워크가 구축되기 전에 매우 약하기 쉬우며, 예를 들어 인큐베이터에서 꺼내거나 배지를 교체하는 동안 매우 조심스럽게 다루어야 합니다. 우물 바닥에서 분리되어 매체에서 수영하는 DRG는 실패한 재배를 보여줍니다. Schwann 세포의 경우, 다양한 배양 조건 및 보충제(예: 배지 내 혈청)로 인한 증식 속도 변화는 공배양에 대한 도전이 될 수 있습니다. 배양 물이 과도한 수의 슈반 세포에 의해 자라면 우물 바닥에서 분리되어 사용할 수 없게됩니다. 따라서 배양에서 Schwann 세포 수를 적정하는 것이 좋습니다. Schwann 세포 프로토콜을 설정하는 동안 SOX10 또는 S100 면역염색을 사용하여 순.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
조언과 지원을 해주신 Ralf Gold 교수님과 Gisa Ellrichmann 박사님께 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anti-MBP, 토끼 | Novus Biologicals, Centannial, 미국 | ABIN446360 | |
| Anti-ß III-튜불린, 마우스 | Biolegend, 미국 샌디에이고657402 | ||
| 아스코르브산 | Sigma Aldrich GmbH, 독일 슈타인하임 | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, 슈베르테, 독일 | 17504-044 | |
| 생물권 필터 팁, 100 &마이크로; L | 사르스테트, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 생물권 필터 팁, 1250 &마이크로; L | 사르스테트, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 생물권 필터 팁, 20 &마이크로; L | 사르스테트, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 생물권 필터 팁, 300 &마이크로; L | 사르스테트, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 70765210 소 혈청 알부민 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| 세포 여과기, 100 & 마이크로; M | BD Bioscience, 하이델베르크, 독일 | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | ||
| 커버슬립 12mm | Carl Roth, 칼스루에, 독일 | P231.1 | |
| 곡선형 세밀한 펜치 | Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일 | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | ||
| 증류수 (정수 시스템) | Millipore, 프랑스 몰스하 | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| 에탄올 | VWR, 래드너, 미국 | ||
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, 독일 스타인하임 | F7524 | FCS는 슈반 세포 배양을 위해 테스트해야 합니다 |
| Fine tysections (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| 염소 안티 마우스 IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| 염소 안티 토끼 IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ 및 Mg2+ 없음) | Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 | ||
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, 독일 하나우 | ||
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 | ||
| 호스 세럼 | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| 레보비츠&급성; s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, 슈베르테, 독일 | ||
| L-글루타민 200 mM | Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 | ||
| MACS 멀티스탠드 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일 | 15000-08 | |
| 현미경 | Motic, Wetzlar, 독일 | Motic BA 400 | |
| 현미경 Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| 현미경 슬라이드 | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS 분리기 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS 컬럼 | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | 보조, 독일 에를랑겐 | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 | ||
| 21103049 NGF | Sigma Aldrich GmbH, 독일 슈타인하임 | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| 파라포름알데히드 | 아크로스 오가닉스, 미국 뉴저지 | ||
| 페니실린/스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 | P4707-50ML | |
| 반응관, 15 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 반응 튜브, 50 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 반응 용기, 1.5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 안전 캐비닛 S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일 | 14083-08 | |
| 혈청 피펫, 10 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 혈청학 피펫, 25 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| 혈청학 피펫, 5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일 | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| 외과용 가위 | Fine Science Tools GmbH, 하이델베르크, 독일 | 14007-14 | |
| TC 접시 100, 셀 + | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| TC 접시 35, 셀 + | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| TC 접시 60, 셀 + | Sarstedt, Nü mbrecht, 독일 | ||
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, 독일 슈타인하임 | X100-500ML | |
| 트리판 블루 솔루션 0.4% | Thermo Fisher Scientific, 독일 슈베르테 | ||
| 트립신(2.5%), 페놀 레드 없음 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, 슈타인하임, 독일 | C1639 | |
| 수조 유형 1008 | GFL, 부르크베델, 독일 | 4285 |
참고문헌
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
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