방법 논문

인간 난포의 유전자 발현 분석

DOI:

10.3791/64807

⸱

2023년 2월 17일

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 유전자 발현 분석을 수행하기 위해 냉동 해동된 피질 조직에서 인간 난포를 분리하는 방법을 설명하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

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난소는 서로 다른 세포 유형으로 구성된 이질적인 기관입니다. 모낭 형성 동안 발생하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 고정 조직에서 단백질 및 유전자 발현의 국소화를 수행 할 수 있습니다. 그러나 인간 난포의 유전자 발현 수준을 적절하게 평가하려면 이 복잡하고 섬세한 구조를 분리해야 합니다. 따라서 Woodruff의 실험실에서 이전에 설명한 적응 된 프로토콜은 난포 (난 모세포 및 과립구 세포)를 주변 환경에서 분리하기 위해 개발되었습니다. 난소 피질 조직은 먼저 조직 슬라이서와 조직 다지기의 두 가지 도구를 사용하여 작은 조각을 얻기 위해 수동으로 처리됩니다. 그런 다음 조직은 최소 40분 동안 0.2% 콜라게나제 및 0.02% DNase로 효소적으로 분해됩니다. 이러한 소화 단계는 37°C 및 5%CO2 에서 수행되고, 매 10분마다 배지의 기계적 피펫팅이 수반된다. 배양 후, 분리된 모낭은 현미경 확대 하에서 보정된 미세모세관 피펫을 사용하여 수동으로 수집됩니다. 모낭이 조직 조각에 여전히 존재한다면, 절차는 수동 미세 해부로 완료됩니다. 모낭은 배양 배지의 얼음 위에 수집되고 인산염 완충 식염수 방울로 두 번 헹구어집니다. 이 소화 과정은 난포 악화를 피하기 위해 신중하게 제어되어야 합니다. 난포의 구조가 손상된 것으로 나타나자마자 또는 최대 90분 후, 10% 소 태아 혈청을 함유하는 4°C 블로킹 용액으로 반응을 중지시킨다. 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 위한 RNA 추출 후 적절한 양의 총 RNA를 얻기 위해 최소 20개의 분리된 모낭(크기 75μm 미만)을 수집해야 합니다. 추출 후 20개의 모낭에서 총 RNA를 정량화하면 평균값 5ng/μL에 도달합니다. 그런 다음 전체 RNA를 cDNA로 역전사하고 RT-qPCR을 사용하여 관심 유전자를 추가로 분석합니다.

서론

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난소는 피질과 간질 내의 난포를 포함하여 기능적 및 구조적 단위로 구성된 복잡한 기관입니다. 난포 형성(folliculogenesis)은 원시 정지 상태에서 수정이 가능하고 초기 배아 발달을 지원할 수 있는 성숙한 난포로 난포의 활성화, 성장 및 성숙 과정으로, 연구1에서 널리 연구되었다. 이 현상을 유발하는 메커니즘을 밝히면 여성의 불임 관리를 개선할 수 있습니다2. 고정된 인간 조직에 대한 분석을 통해 난소의 기능적 단위 내에서 단백질 발현 및 유전자 국소화를 평가할 수 있습니다 3,4. 그러나 난소 난포 내의 유전자 발현 수준을 정확하게 평가하기 위해 주변 피질에서 난포를 분리하는 특정 기술이 필요합니다. 따라서 이전 연구에서는 난소의 기능 단위에서 직접 유전자 발현을 분석할 수 있는 난포 분리 기술이 개발되었다5. 효소 소화 및/또는 기계적 분리, 레이저 캡처 미세 해부와 같은 다양한 접근법이 개발되어 조직 조각내에서 난포 분리를 허용합니다 6,7,8,9. 난포 분리는 발달의 모든 단계에서 난포의 유전자 발현 프로필을 평가하기 위해 인간 또는 동물의 난소 조직과 함께 널리 사용된다10,11,12. 그러나 최적의 격리 절차는 치밀한 피질 내의 난포의 연약한 구조를 고려해야 하므로 손상을 피하기 위해 주의해서 수행해야 한다7. 이 원고는 유전자 발현 분석을 수행하기 위해 냉동-해동된 난소 피질로부터 인간 모낭을 분리하기 위해 Woodruff의 실험실에서 설명한 프로토콜에서 채택된 절차를 설명합니다13.

냉동 된 인간 조직에서 난소 난포 분리의 첫 번째 단계는 해동 절차입니다. 이 과정은 앞서 기술한 바와 같이, 냉동보존된 난소 조직의 이식에 사용되는 임상 프로토콜에 기초하여 수행된다14,15. 이 과정은 배지의 농도를 낮추면서 난소 피질을 헹구어 동결 방지제를 제거하는 것을 목표로 합니다. 그런 다음 모낭을 회수하기 위해 효소 및 기계적 분리 전에 조직을 단편화합니다. 다른 단계의 모낭은 관심있는 것을 분리하기 위해 고배율과 양질의 광학 장치를 갖춘 실체 현미경을 사용하여 구별 할 수 있습니다. 분리된 각 난포는 현미경에 통합된 자를 사용하여 측정되며, 발달 단계에 따라 모낭을 모을 수 있습니다: 원시 난포(30μm), 1차 난포(60μm), 2차 난포(120-200μm) 및 전방 난포(>200μm)16. 추가 분류는 난포의 형태에 따라 수행 될 수 있습니다 : 원시 난포는 편평한 과립구 세포 (GC)의 한 층을 가지며, 1 차 난포는 1 층의 입방체 GC를 가지며, 2 차 난포는 적어도 2 층의 입방체 GC를 가지며, GC 사이의 공동의 존재는 전방 단계를 특징으로합니다. 관심있는 난포가 선택되면 RNA 추출이 수행됩니다. RNA의 양과 질은 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 전에 평가됩니다(그림 1).

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프로토콜

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이 프로젝트는 Erasme Hospital Ethical Committee (벨기에 브뤼셀)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 포함된 환자는 2000년 화학 요법에 노출되기 전에 생식력 보존을 위해 난소 조직 냉동 보존(OTC)을 받았습니다. 환자는 보관 기간이 끝날 때 잔여 냉동 조직을 연구에 기증하겠다는 정보에 입각한 서면 동의서에 서명했습니다.

1. 냉동보존된 난소 조직의 해동

  1. 5개의 해동 용액을 포함하는 6웰 플레이트를 준비합니다. 첫 번째 웰에는 Leibovitz-15 배지, 0.1mol/L 자당, 1.5mol/L 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 1% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 구성된 5mL의 동결 방지 용액이 들어 있습니다. 다음 웰에는 동결 방지제 농도가 감소하는 5mL의 Leibovitz-15 배지가 포함되어 있습니다: 1 mol/L, 0.5 mol/L 및 2 x 0 mol/L DMSO.
    알림: 동결 방지 용액은 불임 클리닉에서 사용되는 프로토콜에 따라 다를 수 있습니다.
  2. 안전 규칙(극저온 장갑, 보호 안경 및 닫힌 신발)에 따라 액체 질소에서 난소 피질 조각이 들어 있는 바이알을 제거하고 튜브를 실온(RT)에서 30초 동안 유지합니다.
  3. 바이알을 RT에서 2분 동안 이중 증류수에 담근 후 수직 후드 아래에서 바이알을 열고 6웰 플레이트(얼음 위)의 첫 번째 웰로 직접 옮깁니다.
  4. 단편을 6-웰 플레이트의 각 웰로 연속적으로 옮기고, 각각은 5mL의 Leibovitz-15 배지에 감소하는 농도의 동결 방지제를 함유합니다. 각 배지의 조직을 5분 동안 부드럽게 교반합니다(얼음 위에서).

2. 난포 격리

참고: 모든 실험은 RNase가 없는 재료를 사용하여 수직 후드 아래에서 수행됩니다.

  1. 해동된 조직을 해부 배지 10mL(Leibovitz-15 배지, 피루브산나트륨[2mmol/L], L-글루타민[2mmol/L], HSA[0.3%], 페니실린 G[30μg/mL] 및 스트렙토마이신[50μg/mL]). 필요한 경우 메스로 조직의 크기를 조정하십시오.
    참고: 임상 프로토콜에 따라 냉동 조직의 크기는 8mm x 4mm x 1mm에서 4mm x 2mm x 1mm까지 다양할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 4mm x 2mm x 1mm의 스트립 2개가 사용되었습니다.
  2. 티슈 슬라이서 3개를 쌓고 두 블록 사이에 조각을 넣고 칼날을 사용하여 조각을 반으로 자르고 블록을 밀어 0.5mm 두께의 조각 2개를 얻습니다.
  3. 티슈 다지기를 사용하여 조각을 자르고 더 작은 조각을 얻습니다. 필요한 경우 조직이 완전히 부서질 때까지 메스로 나머지 조각을 수동으로 자릅니다.
  4. 조각난 조직을 7mL의 소화 배지(배양 배지[McCoy's 5A 배지, 3mmol/L 글루타민, 0.1% HSA, 30μg/mL 페니실린 G, 50μg/mL 스트렙토마이신, 2.5μg/mL 트랜스페린, 4ng/mL 셀레늄 및 50μg/mL 아스코르브산]로 채워진 격자 페트리 접시에 옮기고 0.2% 콜라게나제 및 0.02% DNase로 보충됨).
  5. 접시를 5%CO2 및 37°C의 인큐베이터에 넣는다. 10분마다 페트리 접시를 인큐베이터에서 꺼내고 1mL 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 조직을 세척합니다.
  6. 소화 배지에서 45분 동안 배양한 후 접시를 5x-6.3x 배율 범위의 실체 현미경으로 놓고 미세모세관 피펫을 사용하여 모낭을 회수합니다. 관심있는 모낭을 선택하고 입 피펫으로 빨아 들여 분리하십시오.
    알림: 구강 피펫팅은 파이프로 재료가 손실되어 오염되지 않도록 조심스럽게 수행해야 합니다.
  7. 모낭이 피질 조각에 붙어있는 경우 주사기 끝으로 피질을 뜯어 기질에서 모낭을 분리하여 두 개의 27G 주사기로 기계적으로 분리합니다.
    알림: 모낭이 손상되지 않도록 주사기로 모낭을 만지지 마십시오.
  8. 500 μL의 오일 배양물(방울당 1 내지 10개의 난포)로 덮인 보정된 배양 배지 15 μL의 방울을 함유하는 4-웰 플레이트에 미세모세관이 있는 난포를 옮깁니다. 이 단계는 수집 과정 동안 난포 생존력을 유지합니다. 절차가 끝나면 500μL의 오일 배양액(얼음 위)으로 덮인 15μL의 인산염 완충 식염수(PBS) 두 방울로 매번 5초 동안 모낭을 두 번 헹굽니다.
  9. 빈 튜브에 구강 피펫(최대 10μL)을 사용하여 최소량의 PBS로 20개의 모낭을 수집하고 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
    참고: RNA 안정성을 위해서는 얼음 위에서 2.8단계와 2.9단계를 수행하는 것이 중요합니다. 표준 RT-qPCR(SYBR Green)을 위한 충분한 RNA를 갖기 위해서는 약 20개의 난포(<75μm)가 필요합니다.
  10. 소화 배지에서 최대 90분 동안 배양한 후, 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 배양 배지로 구성된 과량의 저온(4°C) 차단 용액(7.5mL)을 페트리 접시에 첨가하여 효소 반응을 중지합니다.
    참고: 실험자가 플레이트에 달라붙는 모낭이나 손상된 모낭(비대칭 모양 또는 어두운 색의 모낭)을 관찰하는 즉시 차단 용액을 추가할 수 있습니다. 모낭 손상을 피하기 위해 최대 2.5시간 이내에 난포 분리를 수행하고 분리 직후 RNA 추출을 수행하는 것이 좋습니다.

3. RNA 추출

참고: RNA 추출은 용리 부피를 조정하여 RNA 추출 키트와 함께 제공된 지침에 따라 수행됩니다.

  1. RNA 추출 키트와 함께 제공된 용해 용액 100μL를 화학 후드 아래 난포가 들어 있는 튜브에 추가하여 분리된 난포를 현탁하고 고속(2,500rpm/min)으로 소용돌이쳐 난포의 구조를 파괴합니다. 튜브에 50μL의 에탄올(100%)을 넣고 고속으로 잠시 소용돌이칩니다.
    알림: 용해 완충액에는 2-메르캅토에탄올과 티오시안산이 포함되어 있으므로 이 단계는 화학적 후드 아래에서 주의해서 수행해야 합니다.
  2. 튜브의 총 부피(약 160 μL)를 컬럼 및 수집 튜브를 포함하는 마이크로필터 카트리지 조립체로 옮기고, 4°C에서 16,363 x g 에서 10초 동안 원심분리한다. 키트와 함께 제공된 세척 용액 1의 180 μL로 컬럼을 세척하고, 튜브를 4°C에서 16,363 x g 에서 10초 동안 원심분리하였다.
  3. 키트와 함께 제공된 세척 용액 2/3 180μL를 컬럼에 추가하고 4°C에서 16,363 x g 에서 10초 동안 원심분리합니다. 이 단계를 두 번 수행합니다. 튜브를 마지막으로 1분 동안 원심분리하여 필터를 건조시키고 카트리지 아래에 새 수집 튜브를 놓습니다.
  4. 핵산의 용출을 두 단계로 수행하십시오.
    1. 먼저, 8 μL의 따뜻한 용출 용액 (75 °C)을 필터에 넣고, RT에서 1 분 동안 기다렸다가 4 °C에서 16,363 x g 에서 30 초 동안 원심 분리한다.
    2. 7μL의 용출 용액으로 이 단계를 반복합니다.
      참고: 용출된 핵산이 들어 있는 튜브는 얼음 위에 보관해야 합니다. DNA 오염을 방지하기 위해 DNA 분해의 보충 단계인 3.5단계를 적극 권장합니다.
  5. 37°C에서 20분 동안 2 IU DNase 및 1x DNase 완충액으로 튜브를 배양합니다. RT에서 2분 동안 1/10 DNase 불활화 시약으로 효소 활성을 차단합니다.
  6. 튜브를 4°C에서 16,363 x g 에서 1.5분 동안 원심분리합니다. 마지막으로 RNA가 포함된 현탁액을 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.
  7. 분광 광도계(NanoDrop 2000 소프트웨어 > Nucleic Acid > RNA)를 사용하여 샘플에 존재하는 RNA의 양을 평가합니다. 1 μL의 용출 용액을 블랭크로 사용하고, 1 μL의 용액으로 분리된 모낭에서 추출한 RNA 양을 측정합니다.
  8. RNA 순도에 대한 260/280 비율(약 2.0)을 확인합니다. 샘플을 -80°C에서 보관하거나 직접 역전사하여 RT-qPCR을 수행합니다.
    참고: RNA 무결성을 평가하기 위해 -80°C에서 동결하기 전이나 후에 고분해능 자동 전기영동 시스템으로 샘플을 처리할 수 있습니다. 이 작업에서는 역전사 후 RT-qPCR을 다음 주기로 수행했습니다.
    50°C에서 20초, 95°C에서 10분 동안 스테이지를 유지합니다.
    95°C에서 15초, 60°C에서 1분으로 40회 PCR 주기
    95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 95°C에서 30초, 60°C에서 15초의 용융 곡선 단계

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결과

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이 분리 절차를 사용하여 실험자는 기질 환경에서 모낭을 검색하여 특정 유전자 발현 분석을 수행할 수 있습니다. 난포의 크기와 형태에 따라 모낭 형성의 여러 단계를 구별 할 수 있습니다. 실험자는 적응된 미세모세관 피펫을 사용하여 크기에 따라 관심 있는 모낭을 선택할 수 있습니다. 최대 75μm의 미세모세관을 사용하여 원초모낭과 일차난포를 이차, 전방, 성숙한 난포와 구별할 수 있습니다. 또한, 실험자는 난포 형태에 따라 난포 단계를 확인할 수 있다. 난포 활성화를 연구할 때 정지 및 일차 난포가 선택되며 약 5ng/μL의 RNA 농도에 도달하려면 약 20개의 난포가 필요합니다.

동일한 환자로부터 2개의 균질화된 난소 절편(4mm x 2mm x 1mm)을 처리하여 이 프로토콜을 사용하여 난포를 분리했습니다(그림 2). 1.5시간 분리 절차 후, RNA 양을 비교하고 난포 선택의 관련성을 강조하기 위해 발달 단계에 따라 두 개의 ...

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토론

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난소 조직의 냉동 보존은 암 환자의 생식력을 보존하기 위한 유망한 접근 방식입니다. 클리닉에서 해동 된 피질 조직은 완화 후 환자에게 다시 이식되어 난소 기능과 생식력을 재개 할 수 있습니다19,20. 임상적 사용 외에도, 잔류 난소 단편은 또한 모낭 형성을 조절하는 메커니즘을 연구하기 위해 저장 기간이 끝날 때 연구를 위해 기증될 수 있습니다. 또한, 이 조직은 체외 배양 시스템이나 인공 난소와 같이 실현 가능하지 않을 때 이식에 대한 대안을 개발하는 데 특히 유용합니다. 그러나 환자 내외의 차이는 실험의 타당성과 재현성 및 결과의 해석을 제한합니다. 실제로, 난포 밀도는 나이가 들면서 급격히 감소하며, 난포는 단편 사이에 균등하게 분포되어 있지 않다21. 사용 가능한 조각의 수가 제한되어 있기 때문에 인체 조직은 최첨단 기술과 함께 사용해야 합니다. 면역조직화학 ...

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공개 사항

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저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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이 작업은 EOS(Excellence of Science) 보조금(ID: 30443682)의 지원을 받았습니다. I.D.는 Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique(FNRS)의 부연구원입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2mm 격자 페트리 접시Corning430196
2100 Bioanalyzer 기기AgilentG2939BA
2100 Expert 소프트웨어Agilent버전 B.02.08.SI648
4-웰 플레이트Sigma AldrichD6789
6-웰 플레이트Carl Roth  EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513
Ascorbic acidSigma AldrichA4403
미세모세관 피펫용 흡인기 튜브 어셈블리Sigma AldrichA5177
원심분리기Eppendorf5424R
Collagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSO시그마 AldrichD2650
DNase시그마 AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript 역전사 효소PromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-글루타민시그마 AldrichG7513
McCoy' s 5A + 중탄산염 + HepesLifeTechnologies12330-031
McIlwain 조직 초퍼Stoelting51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 µ mCooperSurgical7-72-2200/1
마이크로캐필러리 RI EZ-Tips 75 µ mCooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c 운영 소프트웨어ThermoFisher버전 1.6
NanoDrop 분광 광도계ThermoFisher2000/2000c
페니실린 G시그마 AldrichP3032
PowerTrack SYBR 그린 마스터 믹스ThermoFisherA46109
프라이머 : GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
프라이머: HPRTF: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
프라이머: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
실시간 qPCR Quantstudio 3ThermoFisherA33779
RNAqueous-micro total RNA 분리 키트ThermoFisherAM1931
셀레늄시그마 AldrichS9133
피루브산 나트륨시그마 AldrichS8636
실체 현미경NikonSMZ800
스트렙토마이신 설페이트Sigma AldrichS1277
자당시그마 AldrichS1888
Thermo Scientific Forma 시리즈 II  방수 CO2  인큐베이터ThermoFisher3110
Thomas Stadie-Riggs 조직 슬라이서Thomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

참고문헌

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