방법 논문

Small Molecule Screening Strategies from Lead Identification to Validation(선도물질 식별에서 검증까지 Small Molecule Screening Strategies)

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DOI:

10.3791/64811

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2023년 1월 20일

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

Festa, F., Labaer, J. 자가 조립 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나아제 억제제 스크리닝. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 152, e59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. 뉴클레오시드 리보가수분해효소의 화합물 억제, IC50 값, 인공물 활성 및 전체 세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 분석. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 148, e59928 (2019).

Gao, S. 외. Caenorhabditis elegans의 자동화된 표현형 프로파일링을 통한 화학적 독성 예측을 위한 고처리량 분석법입니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 145, e59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. 부착 세포의 표적 관여를 정량화하기 위해 고함량 이미징 사용. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 141, e58670 (2018).

Chorba, JS, Galvan, AM, Shokat, KM. 단일 턴오버 프로테아제 PCSK9의 단백질 가수 분해를 평가하기 위한 고처리량 루시페라아제 분석. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 138, e58265 (2018).

Sullivan, C. et al. 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염의 제브라피시 모델을 사용하여 항바이러스 약물을 스크리닝하고 숙주 면역 세포 반응을 특성화합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 119, e55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. 항체 어레이에 의한 신호 전달 경로 조사에 의한 티로신 키나아제 억제제에 대한 내성 평가. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 139, e57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. 소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH-coupled ATPase assay의 semi-high-throughput adaptation. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. REPLACE를 통한 단백질-단백질 상호 작용 억제제 개발: 비 ATP 경쟁적 CDK 억제제의 설계 및 개발에 적용. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 104, e52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. 화학 억제제 라이브러리의 스크리닝을 통한 T 세포 수용체 신호의 매개체 식별. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 143, e58946 (2019).

Takakusagi, Y. 약물-단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 166, e61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. HiBiT CRISPR 세포주를 사용한 표적 단백질 분해 화합물의 고처리량 세포 프로파일링. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). 165, e61787 (2020).

사설

유전체학 혁명은 유전적 교란과 다양한 질병 표현형 사이의 연관성에 대한 방대한 양의 지식을 가져왔습니다1. 이로 인해 수많은 단백질이 잠재적인 약물 표적으로 주석화되었고 이러한 표적을 억제하는 화합물의 발견 및 개발에 대한 관심이 촉발되었습니다2. 이러한 맥락에서 다양한 스크리닝 전략이 히트 화합물 발견, 표적 검증, 결합 친화도 측정, 선택성, 독성 및 세포 내 표적 결합은 물론 화합물 반응성, 안정성 및 약동학 특성을 위한 중요한 접근 방식으로 등장했습니다. 이 컬렉션은 소분자의 생화학적 및/또는 생물학적 활성을 스크리닝하고 평가하는 데 사용할 수 있는 다양한 전략을 보여주는 것을 목표로 이 분야의 방법론적 발전 중 일부를 포착합니다.

단백질 키나아제는 500개 이상의 구성원을 가진 대규모 효소 계열을 나타냅니다. 이 효소는 모든 세포 과정의 핵심 조절자이며 이들의 오기능은 수많은 질병과 관련이 있습니다3. 따라서 그들은 신약 발견과 더 나아가 방법론 개발에 대한 집중적인 관심의 초점이었습니다. 따라서 이 컬렉션의 4개 기사는 이 분야의 발전에 대해 보고합니다. Festa et al. 자가 조립 핵산 프로그래밍 가능한 단백질 어레이(NAPPA)를 사용하는 키나아제 억제제 발견을 위한 스크리닝 플랫폼을 설명합니다4. 이 어레이는 전장 인간 키나아제를 표시하고 대규모 키나아제 컬렉션에서 화합물의 다중 스크리닝을 허용하므로 히트를 식별할 뿐만 아니라 프로파일링 선택성도 허용합니다. Tieman et al. 키나아제 억제제 활성의 판독값으로서 인산화 상태의 세포 전체 변화를 스크리닝하기 위해 개발된 인산항체 마이크로어레이 기반 방법을 설명합니다5. 이는 약물 반응 및 효능을 이해하는 데 중요한 매개변수인 억제에 내성이 생긴 경로의 특성에 대한 통찰력으로 이어질 수 있습니다. Chen et al. T 세포 수용체(TCR) 신호 전달에 영향을 미치는 화합물을 식별하기 위해 키나아제 억제제 컬렉션을 스크리닝하기 위한 유세포 분석 분석을 설명합니다6. 이 전략은 TCR 신호 전달에 관여하는 키나아제의 신속한 식별로 이어졌고, 이는 면역치료제 개발의 표적으로서의 잠재력을 나타냅니다. 마지막으로, 많은 키나아제의 활성은 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 통해 조절되며, 이는 이러한 PPI를 표적으로 하는 화합물이 흥미로울 수 있음을 시사합니다. Nandha Premnath et al. 펩타이드 결합제의 특징을 동일한 결합 표면에 관여하는 작은 분자로 변환하여 키나아제의 비ATP 경쟁적 PPI를 개발하는 데 사용할 수 있는 REPLACE(전산 농축을 사용한 부분 리간드 대안으로 대체)라는 방법을 설명합니다7.

키나아제 외에도 다른 많은 효소가 질병에서 역할을 하며 신약 발견에 연구되어 왔습니다. 따라서 키나아제 이외의 효소에 최적화된 방법도 흥미롭습니다. 예를 들어, Stockman et al. 기생충 Trichomonas vaginalis8에서 뉴클레오사이드 리보가수분해효소의 억제제를 발견하고 평가하기 위한 핵자기공명(NMR) 분광법 기반 활성 분석을 설명합니다. 이러한 분석은 IC50 값의 결정에도 사용할 수 있습니다. ATPase 억제제를 스크리닝하기 위해 Radnai et al. 궁극적으로 ATPase 활성을 판독으로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)의 고유 형광으로 변환하는 두 가지 효소(피루베이트 키나아제 및 젖산 탈수소효소)를 포함하는 결합 효소 분석 형식을 사용하는 반고처리량 스크리닝 방법을 개발했습니다 9. 지금까지 설명된 모든 효소가 진행적이고 여러 단계를 촉매하는 것과 달리, 프로단백질 전환효소 서브틸리신/켑신 9형(PCSK9)은 기질에 의해 자가억제되는 단일 턴오버 프로테아제입니다. 이로 인해 PCSK9 억제제에 대한 스크리닝이 어려워지며, Chorba et al. PCSK9 절단 활성을 분비된 루시페라제 활성에 판독값으로 연결하여 억제제에 대한 스크리닝을 가능하게 하는 고처리량 세포 기반 방법을 설명합니다10.

다양한 표적의 활성을 억제하는 화합물을 찾는 것 외에도 화합물이 세포에서 의도한 표적과 관여함을 확인하는 분석도 높은 관심을 끌고 있습니다. Axelsson et al. 면역형광 항체에 의한 고함량 이미징과 세포 열 이동 분석(CETSA)11의 결합을 기반으로 부착 세포에서 표적 결합을 검증하기 위한 전략을 설명합니다. 이 분석은 안정화 화합물을 식별하기 위해 대규모 화합물 컬렉션으로 처리된 세포에 등온 열 챌린지를 사용합니다. Riching 등이 개발한 분해제 분자의 표적 교합 및 활성을 평가할 수 있는 방법은 HiBiT/LgBiT 태깅 기술을 사용하여 발광 단백질을 생성하고 발광 감소를 통해 분해 매개변수를 모니터링합니다12. 마지막으로, Takakusagi et al. 약물 결합 펩타이드 모티프와 소분자 사이의 결합을 스크리닝하기 위해 파지 기반 펩타이드 디스플레이를 사용하는 것을 기반으로 하는 단백질-약물 상호작용을 검증하는 방법을 설명합니다13. 펩타이드 디스플레이 화면은 표적 결합을 검증하기 위해 생물정보학 분석과 결합됩니다.

소분자 검증의 또 다른 계층은 동물 모델에서의 효과의 특성화입니다. 이 컬렉션에는 항바이러스 활성을 갖는 화합물의 효능과 숙주 면역 반응을 평가하기 위해 인간 인플루엔자 A 바이러스 감염의 제브라피쉬(Danio rerio) 모델을 사용하는 방법(14)과 화합물 독성을 프로파일링하기 위한 모델로 Caenorhabditis elegans 를 사용하는 방법(15)이 포함됩니다. 이 두 연구 모두 생체 내 효능과 독성을 평가할 수 있는 최적화된 방법의 필요성을 강조합니다.

결론적으로, 신약 발견 및 개발은 수많은 병목 현상, 과제 및 높은 실패 확률이 있는 만만치 않은 프로세스입니다. 또한, 약물 내성 병원체의 수가 놀라운 속도로 증가하고 있는 전염병 분야나 만성 질환 및 고령화와 관련된 질병의 유병률이 증가하는 분야 등 지속적인 질병 부담은 우리의 집중적인 관심과 행동을 요구합니다. 이 컬렉션은 약물 발견, 검증 및 특성화를 가속화하는 것을 목표로 하는 여러 가지 방법을 강조합니다. 앞으로 우리는 이 분야에서 특히 스크리닝 처리량 향상, 화학 라이브러리의 다양성 증가, 고처리량 스크리닝(HTS)과 호환되는 생체 내 모델 개발을 목표로 하는 분야에서 더 많은 혁신을 볼 수 있을 것으로 기대합니다. 또한 효능, 선택성, 특이성, 효능 및 독성에 대한 전체적인 관점을 더 빠르고 작은 규모로 제공하는 워크플로우가 특히 가능할 수 있습니다.

공개 사항

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감사의 글

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참고문헌

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

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Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

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