이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.
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이 논문에서
요약
초록
Ca2+ 이미징은 세포질 내로의 Ca2+ 진입 또는 세포내Ca2+ 저장소의 방출을 수반하는 활동 전위 및 다양한 신호전달 메카니즘을 포함하는 세포 활성에 대한 프록시로서 사용될 수 있다. 마우스에서 후근 신경절(DRG)의 일차 감각 뉴런의 Pirt-GCaMP3 기반Ca2+ 이미징은 많은 수의 세포를 동시에 측정할 수 있는 이점을 제공합니다. 최대 1,800개의 뉴런을 모니터링할 수 있으므로 뉴런 네트워크와 체성 감각 과정을 생체 내 인구 수준에서 정상적인 생리학적 맥락에서 앙상블로 연구할 수 있습니다. 모니터링되는 많은 수의 뉴런을 통해 다른 방법을 사용하여 감지하기 어려운 활동 패턴을 감지할 수 있습니다. 자극은 마우스 뒷발에 적용될 수 있으며, DRG 뉴런 앙상블에 대한 자극의 직접적인 효과를 연구 할 수 있습니다. Ca 2+ 과도 현상을 생성하는 뉴런의 수 및 Ca2+ 과도 현상의 진폭은 특정 감각 양식에 대한 민감도를 나타낸다. 뉴런의 직경은 활성화된 섬유 유형(무독성 기계 대 유해 통증 섬유, Aβ, Aδ 및 C 섬유)의 증거를 제공합니다. 특정 수용체를 발현하는 뉴런은 Pirt-GCaMP와 함께 td-Tomato 및 특정 Cre 재조합 효소로 유전적으로 표지될 수 있습니다. 따라서 DRG의 Pirt-GCaMP3 Ca2+ 이미징은 통증, 가려움증, 촉각 및 기타 체성 감각 신호를 연구하기 위해 인구 수준에서 앙상블 역할을 하는 특정 감각 양식 및 뉴런 하위 유형을 분석하기 위한 강력한 도구와 모델을 제공합니다.
서론
일차 감각 뉴런은 피부를 직접 자극하고 체성 감각 정보를 중추 신경계로 다시 전달합니다 1,2. 등근 신경절(DRG)은 10,000-15,000개의 일차 감각 뉴런으로 구성된 세포체 클러스터입니다 3,4. DRG 뉴런은 다양한 크기, 수초화 수준, 유전자 및 수용체 발현 패턴을 나타냅니다. 더 작은 직경의 뉴런은 통증을 감지하는 뉴런을 포함하며, 더 큰 직경의 뉴런은 전형적으로 통증이 없는 기계적 자극에 반응한다 5,6. 손상, 만성 염증 및 말초 신경 병증과 같은 일차 감각 뉴런의 장애는 이러한 뉴런을 다양한 자극에 민감하게 만들고 만성 통증, 이질통 및 통증 과민증에 기여할 수 있습니다 7,8. 따라서 DRG 뉴런에 대한 연구는 일반적으로 체성 감각과 많은 통증 및 가려움 장애를 이해하는 데 중요합니다.
생체....
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프로토콜
여기에 설명된 모든 절차는 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교 보건 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
참고: 일단 시작되면 동물 수술(1단계)과 영상(2단계)을 연속적으로 완료해야 합니다. 데이터 분석(단계 3)은 추후 수행될 수 있다.
1. 우측 L5 DRG 이미징을 위한 수술 및 동물 고정
참고: 8주령 이상의 수컷과 암컷 Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 마우스 모두 이 연구에 사용되었습니다. 성별 모두 동등하게 잘 이미지화 될 수 있지만, 어린 마우스에서 Pirt 발현이 약하거나 간헐적이기 때문에 마우스는 최소 8 주령이어야합니다. Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 마우스는 존스 홉킨스 대학14에서 생성되었습니다. 어느 한 쪽의 DRG가 영상화될 수 있고, 다른 요추 DRG(예를 들어, 요추 4)가 영상화될 수 있다. 주어진 시간은 숙련 된 외과 의사에 대한 추정치입니다. 출혈 증가와 같은 간헐적인 기술적 문제로 인해 필요한 시간이 늘어날 수 있습니다.
- 40mg/mL 케타민과 6mg/mL 자....
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결과
그림 4: Pirt-GCaMP3 마우스의 L5 등쪽 뿌리 신경절의 대표 이미지. (A,D) Pirt-GCaMP3 마우스의 L5 등쪽 뿌리 신경절의 단일 프레임 고해상도 스캔이 표시됩니다. (비,이) . 자극이 없는 경우 패널 A와 패널 D에서 각각 Pirt-GCaMP3 L5 DRG 신경절의 15프레임의 평균 강도 투영. 자발적인 Ca2+ 과도 현상을 생성한 일부 뉴런은 노란색 화살표로 호출됩니다. (C) 100g 뒷발 프레스 동안 패널 A에서 자극 전 2프레임 및 Pirt-GCaMP.......
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토론
지속적인 통증은 다양한 장애에 나타나며, 약 8%의 사람들의 삶의 질을 쇠약하게 하거나 감소시킨다29. 일차 감각 뉴런은 피부의 유해한 자극을 감지하며, 그 가소성은 지속적인 통증에 기여합니다8. 뉴런은 세포 배양 및 외식편에서 연구할 수 있지만 그렇게 하면 정상적인 생리학적 맥락에서 제거됩니다. DRG의 외과적 노출에 이어 Pirt-GCaMP3 Ca2+ 이미징을 통해 뒷발에 가해지는 자극을 사용하여 정상적인 생리학적 맥락에서 일차 감각 뉴런을 연구할 수 있습니다. 이러한Ca2+ 이미징 방법의 주요한 이점은 많은 수의 뉴런이 동시에 모니터링될 수 있다는 것이다. 이 방법을 사용하면 모달리티, 뉴런 직경 및 결합 활성화 10,11,12,13,14,15,16,17,30과 같은 희귀 현상의 집단 수준에서 분석하여 정상 및 병리학적 체성 감각에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.<.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원 보조금 R01DE026677 및 R01DE031477(YK), UTHSCSA 스타트업 펀드(Y.S.K.) 및 텍사스 대학교 시스템(YSK)의 Rising STAR Award의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
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| 곡선형 Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| DC 온도 컨트롤러 | FHC | 40-90-8D | |
| DC 온도 컨트롤러 가열 패드 | FHC | 40-90-2-05 | |
| Dumont 세라믹 코팅 집게 | 정밀 과학 도구 | 11252-50 | |
| FHC DC 온도 컨트롤러 | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (Isoflurane) | MWI 동물 건강, Piramal Group | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| 발광 녹색 무대 테이프 | JSITON / Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 Isoflurane 기화기 | Midmark | 91305430 | |
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| Micro 해부 스프링 가위 | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| 마이크로 해부 스프링 가위 | Roboz | RS-5677 | |
| 미니 직장 서미스터 프로브 | FHC | 40-90-5D-02 | |
| 작동 가위 | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 마우스 | 존스 홉킨스 대학교 | N/A | 어느 성별이든 똑같이 잘 이미지화될 수 있습니다. 생쥐는 생후 8주 이상이어야 하는데, 이는 어린 생쥐에서 약하거나 간헐적인 Pirt 프로모터 발현으로 인해 발생합니다. |
| SMALGO 소동물 알고리즘 | Bioseb 생체 내 연구 기기 | BIO-SMALGO | |
| 입체 구조 | Kopf 모델 923-B | 923-B | |
| td-토마토 C57BL/6J 마우스 | Jackson Laboratory | 7909 | |
| 상판, 6인치 x 10인치 | Newport | 290-TP | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J 마우스 | Jackson Laboratory | 17769 | |
| Zeiss LSM 800 컨포칼 현미경 | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 블루 에디션 소프트웨어 | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
참고문헌
- Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
- Wessels, W. J., Marani, E.
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