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방법 논문

생쥐에서 급성 골수성 백혈병을 발생시키기 위한 복강내 이식

2.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64834

⸱

2023년 1월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

이 논문에서

요약

여기서, 백혈병 세포의 복강 내 주사는 마우스에서 급성 골수성 백혈병(AML)을 확립하고 전파하는 데 활용됩니다. 이 새로운 방법은 AML 세포의 연속 이식에 효과적이며 생쥐에서 정맥 주사에 어려움과 불일치를 경험할 수 있는 사람들을 위한 대안이 될 수 있습니다.

초록

급성 골수성 백혈병(AML) 및 지속성 백혈병 줄기 세포(LSC)와 관련된 관련 재발을 치료하기 위한 새로운 치료법에 대한 미충족 수요가 있습니다. 수용자 마우스에 역궤도 주사를 통해 이러한 세포를 성공적으로 이식하는 것을 기반으로 하는 치료법을 테스트하기 위한 실험적 AML 설치류 모델은 도전 과제로 가득 차 있습니다. 이 연구의 목적은 복강 내 경로를 사용하여 AML의 강력한 쥐 모델을 생성하는 쉽고 신뢰할 수 있으며 일관된 방법을 개발하는 것이었습니다. 본 프로토콜에서, 골수 세포는 인간 MLL-AF9 융합 종양 단백질을 발현하는 레트로바이러스로 형질도입되었다. 원발성 AML의 발달에서 기증자 LSC로서 계통 음성(Lin-) 및 Lin-Sca-1+c-Kit+(LSK) 집단의 효율성을 테스트하고 AML을 생성하는 새로운 방법으로 복강내 주사를 채택했습니다. 복강내 주사와 안와후부 주사의 비교는 두 가지 방법을 비교하고 대조하기 위해 연속 이식에서 수행되었습니다. 인간 MLL-AF9 바이러스로 형질도입된 Lin- 및 LSK 세포는 모두 수용자의 골수와 비장에 잘 생착되어 완전한 AML로 이어집니다. 연속 이식 시 공여자 세포의 복강 내 주사로 수혜자에게 AML이 형성되었고, 유세포 분석, qPCR 및 조직학적 분석을 통해 수혜자의 혈액, 골수, 비장 및 간에서 AML 세포의 침윤이 검출되었습니다. 따라서, 복강내 주사는 기증자 백혈병 세포의 연속 이식을 이용한 AML 유도의 효율적인 방법이다.

서론

급성 골수성 백혈병(AML)은 예후가 좋지 않은 다양한 병인의 혈액학적 악성 종양의 일종이다1. AML 동물 모델의 생성은 새로운 치료법을 발견하기 위한 노력의 일환으로 복잡한 변이와 병리학을 이해하기 위한 토대를 마련한다2. 생쥐의 백혈구 생성은 혼합 혈통 백혈병(mixed lineage leukemia, MLL) 유전자를 포함하는 융합체를 포함하여 융합 종양 단백질을 발현하는 공여 세포를 이식하여 AML을 강력하게 유도하여 인간의 질병을 모방하는 것을 포함한다3. MLL 유전자 관련 AML4의 이식에서 공여자 세포의 다양한 세포 기원이 보고되었으며, 질병 기원을 담당하는 세포에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

생쥐 이식을 위해 여러 경로가 개발되었습니다. 돌연변이 공여 세포를골수 내로 직접 도입하는 대퇴골 내 주사 5 대신, 정맥동 신경총, 꼬리 정맥 및 경정맥을 이용하는 정맥 주사가 쥐 AML 모델 6,7,8,9을 생성하는데 널리 사용되어 왔다. retro-orbital (r.o.) 주사의 경우, 부피 제한, 높은 기술적 요구, 반복적인 시도 또는 오류의 가능성 적음, 잠재적인 안구 손상과 같은 다양한 내재적 단점이 제한적이거나 실행 가능한 대안이 없는 주요 걸림돌이 되었습니다7. 꼬리 정맥 주사는 국소 부상 외에도 유사한 문제를 가질 수 있습니다. 시술을 용이하게 하기 위해, 생쥐는 종종 꼬리 정맥을 확장시키기 위해 워밍업을 할 필요가 있다10. 또한 추가 광원 없이는 꼬리 정맥을 찾기가 어려우며, 특히 C57BL/6 균주의 마우스에서 그렇습니다. 경정맥 주사의 경우 연구 인력은 정맥을 찾고 가능한 합병증을 제한하기 위해 충분한 교육이 필요합니다. 또한 정맥동과 경정맥 주사는 모두 마취하에 수행해야하므로 또 다른 수준의 복잡성이 추가됩니다. 따라서 AML 쥐 모델의 확립을 촉진하기 위해 이식을 위한 새로운 경로를 탐색하고 싶은 유혹이 있습니다.

복강내(i.p.) 주사는 일반적으로 약물, 염료 및 마취제를 투여하는 데 사용된다 11,12,13,14,15; 또한 이소성 조혈을 위한 조혈 세포를 도입하고(16) 다양한 마우스 모델(17,18,19,20,21)에서 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 이식하는 데 사용되어 왔다. 그러나 마우스에서 조혈 악성 종양을 확립하는 데 자주 사용되지 않았으며, 특히 AML 질병 진행을 연구하는 데 사용되지 않았습니다.

본 연구는 기증자 세포로서 계통 음성(Lin-) 및 Lin-Sca-1+c-Kit+(LSK) 집단의 이식 효율을 비교하는 것 외에도 AML 마우스 모델 생성에서 IP 주입의 타당성을 설명합니다. 이러한 발견은 AML 및 관련 골수성 백혈병의 실험 모델을 생성하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이러한 방법은 질병 메커니즘에 대한 이해를 넓힐 뿐만 아니라 실험적 치료법을 테스트하기 위한 비교적 쉬운 모델을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

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프로토콜

모든 실험은 펜실베니아 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인을 받았습니다.

1. 완충액 및 시약의 제조

  1. 암피실린 보충 (AP) LB 한천 플레이트 (멸균 10cm 플레이트)를 준비하십시오. 이렇게하려면 400mL의 증류수에 한천과 함께 LB 국물 10g을 녹이고 저어주고 부피를 500mL까지 가져옵니다. 고압증기멸균으로 용액을 멸균한 다음 용액을 식히고 0.5mL의 암피실린(스톡: 150mg/mL)을 용액에 넣고 흔들어 혼합합니다. 즉시 알코올 램프 근처의 멸균된 10cm 플레이트에 18mL의 용액을 추가하고 실온에서 응고시킨 다음 추가 사용이 있을 때까지 플레이트를 4°C에서 거꾸로 보관합니다.
  2. 500mL의 증류수에 한천 없이 LB 10g을 용해시켜 LB 배지를 준비합니다. 고압증기멸균으로 용액을 멸균하고 용액을 식히고 0.5mL의 암피실린(스톡: 150mg/mL)을 용액에 넣고 흔들어 혼합합니다.
  3. 페니실린/스트렙토마이신 5mL와 열 비활성화 소 태아 혈청(hiFBS) 10mL를 1x 덜베코 인산염 완충 식염수(DPBS) 485mL에 추가하여 플로우 버퍼를 준비합니다.
    알림: 가열하여 FBS를 비활성화하려면 해동된 FBS 병을 56°C 수조에 넣으십시오. 병이 넘어지거나 수조에 잠기지 않도록 하십시오. 온도는 완전한 분해에 매우 중요합니다. 이를 위해 병을 수조에 넣은 후 온도가 56°C에서 안정화될 때까지 기다리십시오. 10분마다 병을 세 번 부드럽게 휘젓습니다. 혈청이 30분 이상 배양되지 않도록 하십시오.
  4. 50mL의 HiFBS, 5mL의 L-글루타민 및 5mL의 페니실린/스트렙토마이신을 440mL의 Dulbecco's modified eagle 배지(DMEM)에 추가하여 유지 관리 배지를 준비합니다. 50mL의 hiFBS와 5mL의 L-글루타민을 445mL의 DMEM 배지에 첨가하여 형질주입 배지를 준비합니다.
  5. 증류수 500mL에 NH4Cl 4.145g, NaHCO3 0.504g, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 16.81mg을 첨가하여 적혈구(RBC) 용해 완충액을 준비한다. 75mL의 hiFBS, 5g의 소혈청알부민(BSA), 0.5mL의 10mg/mL 인슐린, 2.5mL의 4mg/mL 홀로-트랜스페린, 3.5μL의 β-메르캅토에탄올, 5mL의 L-글루타민, 0.5mL의 시프로플록사신을 416.5mL의 IMDM 배지에 첨가하여 불완전한 Iscove의 변형 Dulbecco's medium(IMDM) 배지를 준비합니다.
  6. 50 ng/μL mr-SCF 10 μL, 25 ng/μL mr-Flt3L 20 μL, 10 ng/μL mr-IL-6 20 μL, 10 ng/μL mr-IL-3 20 μL, 10 mg/mL 인슐린 10 μL을 첨가하여 사이토카인 농도가 1x IMDM 배지 양의 2배인 2x IMDM 배지 10mL를 준비하고, 및 50μL의 4mg/mL 홀로-트랜스페린을 9.87mL의 불완전한 IMDM 배지에 넣습니다.
    참고: 사용 전에 플로우 버퍼, RBC 용해 버퍼, 유지 관리 배지, 형질주입 배지 및 불완전한 IMDM 배지를 필터 멸균해야 합니다.

2. 플라스미드 형질전환

  1. α-Select 컴피턴트 세포 20μL를 얼음 위에서 해동합니다. 해동된 컴피턴트 세포에 MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 플라스미드22 1μL(~2ng)를 추가하고 튜브를 두드려 부드럽게 혼합합니다. 반응을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 혼합물을 42°C 가열 블록에서 40초 동안 인큐베이션하여 열 충격을 가한다. 즉시 튜브를 얼음 위에서 2분 동안 옮깁니다.
  3. LB 배지(암피실린 제외) 1mL를 튜브에 넣고 37°C 및 200rpm에서 1시간 동안 흔들어 줍니다.
  4. 튜브를 실온에서 500 x g 로 4분 동안 원심분리하고 0.9mL의 상층액을 버립니다. 나머지 0.1mL의 LB 배지에 침전물을 재현탁합니다.
  5. 형질전환된 컴피턴트 세포를 예열된(37°C) AP LB 한천 플레이트 상에 펼친다. 플레이트를 37°C에서 12-16시간 동안 거꾸로 배양합니다.
  6. 단일 콜로니를 선택하고 형질전환된 세포를 37°C 및 200rpm에서 하룻밤 동안 10mL의 AP LB 배지에 소비합니다.
  7. 플라스크 내의 500 mL의 AP LB 배지에 5 mL의 소비된 형질전환된 컴피턴트 세포를 첨가하고, 플라스크를 37°C 및 200 rpm에서 밤새 인큐베이션한다.
  8. 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고 오토클레이브 초순수 0.5mL에 재현탁합니다. 분광광도계를 사용하여 플라스미드를 정량합니다.

3. Phoenix Ecotropic(pECO) 세포의 형질주입

  1. 37°C의 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 10cm 플레이트의 유지 배지에서 2 x 106 pECO 세포/플레이트를 배양합니다. pECO 세포가 기하급수적 성장 단계로 유지되고 계대 전에 활발하게 분열하는지 확인합니다.
  2. 세포가 80% 융합이 되면, 플레이트를 5 mL의 DPBS로 2회 세척하고, 1 mL의 트립신을 플레이트에 첨가하고, 37°C에서 2분 동안 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 멸균된 15mL 튜브에서 5mL의 유지 배지로 세포를 수확하고 4°C 및 400x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 5mL의 유지 관리 배지에 재현탁합니다.
  3. 10 μL의 세포 현탁액과 10 μL의 트리판 블루를 혼합하고 10 μL를 혈구계에 로드하여 세포 수를 세십시오.
    총 세포/mL = (계수된 총 세포 x 희석 계수 x 104 cells/mL)/ 계수된 제곱 수)
    형질주입을 위해 5 mL의 유지 배지를 사용하여 2 x 10 6 세포/접시를6 cm 접시에 넣고 37°C에서 가습된 5%CO2 배양기에서 세포를 배양하였다.
  4. 배양 18시간 후 세포가 50%-60% 합류하게 되면 유지 배지를 5mL의 형질주입 배지로 교체합니다.
  5. 형질주입 시약을 형질주입 전에 적어도 30분 동안 실온에 보관한다.
  6. 5.5μg의 MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 플라스미드22 를 멸균된 1.5mL 튜브의 일반 DMEM 배지 0.5mL에 추가합니다. 튜브를 두드려 부드럽게 섞고 10분 동안 그대로 두십시오.
  7. 14.6μL(플라스미드 양의 3배, v/w)의 형질주입 시약을 튜브에 넣고 10분마다 튜브를 세 번 가볍게 두드립니다.
  8. 형질주입 배지에서 pECO 세포가 있는 접시의 모든 영역에 혼합물을 균일하게 적가합니다. 접시를 앞뒤로 10 번, 옆으로 10 번 부드럽게 움직입니다. 접시를 37°C에서 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
  9. 도 22에 기재된 바와 같이 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대한 형광 현미경 및 유동 세포측정법에 의해 형질주입 효율을 측정한다. 세포는 먼저 FSC-A/FSC-H 및 FSC-A 및 SSC-A에서 게이트되어 단일항을 획득합니다. GFP+ 집단은 형질감염되지 않은 세포와 비교하여 FL1 플롯에서 게이팅됩니다.
  10. 0.45μm 주사기 필터를 통해 상층액을 수집하고 멸균된 50mL 튜브로 여과합니다. 상층액을 즉시 형질 도입에 사용하거나 액체 질소에서 급속 동결하고 추가 사용이 가능할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
    참고: pECO 세포는 접시에 균일하게 적절하게 혼합되고 파종되어야 합니다. 파종하는 동안 접시를 앞뒤로 10번, 옆으로 10번 움직여 세포가 퍼지도록 합니다. 파종할 세포 수는 카운팅의 변화에 따라 달라질 수 있습니다. 18시간 배양 후 50%-60% 합류를 달성할 수 있는 최적의 파종 세포 수를 찾으려면 연속 희석으로 파종 세포가 도움이 됩니다.

4. 렌티바이러스 형질도입

  1. 8-10주령의 CD45.1 암컷 C57BL6/J 마우스(수용자 마우스당 2 내지 3마리의 기증자 마우스)를CO2 챔버에서 안락사시킨다.
  2. 생쥐의 몸 전체를 70 % 에탄올로 소독하십시오. 마우스를 스티로폼 보드의 멸균 수술 패드에 놓고 마우스 발 패드를 통해 다리를 고정합니다.
  3. 정중선에서 복강 위의 피부를 자르고 날카로운 끝 멸균 가위로 뒷다리쪽으로 피하 공간을 넓힙니다.
  4. 복부 정중선에서 발목까지 절개를 확장합니다. 날카로운 끝 멸균 가위로 뒷다리 아래의 피하 공간을 넓히십시오.
  5. 끝이 뾰족한 멸균 가위로 아킬레스건을 자릅니다. 이빨이 있는 집게를 사용하여 힘줄을 잡고 대퇴골에 부착된 다른 쪽 끝을 잘라 비복근을 제거합니다.
  6. 무릎에 부착된 대퇴사두근 힘줄을 날카로운 멸균 가위로 자릅니다. 집게를 이빨로 잡고 대퇴골에 붙어있는 근육을 잘라 비복근을 제거합니다.
  7. 경골에 부착된 끝에서 대퇴골을 둘러싼 다른 근육을 날카로운 끝의 멸균 가위로 자릅니다.
  8. 날카로운 끝의 멸균 가위로 발목을 잘라 경골이 손상되지 않도록하십시오. 치아가 있는 집게를 사용하여 대퇴골의 말단부를 잡고 끝이 날카로운 멸균 가위로 고관절을 절단하여 대퇴골두가 손상되지 않도록 합니다.
  9. 경골과 대퇴골을 멸균된 15mL 튜브의 유동 완충액으로 옮깁니다.
  10. 손으로 무릎을 부러 뜨려 경골과 대퇴골을 분리하십시오. 슬개골, 연골 및 대퇴골 과두를 제거하여 경골 고원과 원위 대퇴골을 손으로 노출시킵니다. 멸균 거즈를 사용하여 근육을 제거한 다음 뼈를 흐름 완충액에 담급니다.
  11. 대퇴골 경부를 절단하고 23G 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 대퇴골 양쪽 끝의 유동 완충액으로 골수 세포를 플러시합니다.
  12. 경골 복사뼈를 절단하고 23G 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 경골 양쪽 끝에서 유동 완충액으로 골수 세포를 플러시합니다.
  13. 18G 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 위아래로 피펫팅하여 세포를 분산시킵니다. 단일 세포 현탁액을 4°C 및 400 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
  14. 상층액을 버리고 5mL의 RBC 용해 완충액에 세포를 재현탁하여 3분 동안 RBC를 용해합니다.
  15. 용해를 중지하기 위해 5 mL의 유동 완충액을 첨가하고, 세포 현탁액을 4°C 및 400 x g 에서 3분 동안 원심분리한다.
  16. 70μm 셀 스트레이너를 멸균된 50mL 튜브에 놓습니다. 펠릿을 5mL의 유동 완충액으로 현탁하고 혼합한 다음 세포 여과기를 통과시켜 세포를 수집합니다.
  17. 유동 완충액으로 세포 농도를 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브에서 1 x 108/mL로 조정합니다.
  18. 제조업체의 지침에 따라 마우스 조혈 세포 분리 키트를 사용하여 Lin- 세포를 선택합니다.
  19. 염색되지 않은 대조군 1개와 APC 접합 항마우스 CD117(c-Kit) 및 PE-Cy7 접합 항마우스 Ly-6A/E(Sca-1)에 대한 단일 항체 염색 대조군 2개를 위해 100μL 완충액에 1 x 104 개의 세포로 구성된 튜브 3개를 따로 보관하십시오. 단일 항체 염색 대조군 각각에 대해 1μL의 항체(0.2mg/mL 스톡에서)를 사용합니다.
  20. 400 μL의 두 항체(0.2mg/mL 스톡에서 각각 4μL)가 있는 튜브의 나머지 세포를 염색합니다.
  21. 염색 후, 1 mL의 유동 완충액을 첨가하고 4°C에서 400 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 세척하였다.
  22. 염색되지 않은 대조군 및 단일 항체 염색 대조군에 대한 세포를 100 μL의 유동 완충액에 재현탁합니다. 이중 항체 염색 세포를 분류를 위해 1mL의 유동 완충액에 재현탁합니다.
  23. 조혈 줄기 세포 (HSCs)를23,24에 기재된 바와 같이 세포 분류기를 사용하여 LSK 집단으로서 분류한다.
  24. 염색하는 동안 멸균된 6cm 접시에 다음과 같이 레트로넥틴을 코팅합니다: PBS에 100μg/mL의 레트로넥틴 스톡을 준비하고 0.9mL의 PBS와 0.1mL의 레트로넥틴을 6cm 접시에 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 멸균 후드에 접시를 코팅하십시오. 이어서, 레트로넥틴을 제거하고, 30분 동안 0.5 mL의 여과된 2% BSA(PBS 중)로 접시를 차단한다. 5mL의 PBS로 접시를 두 번 씻으면 접시가 형질 도입 준비가 됩니다.
  25. 분류된 HSC 또는 분류되지 않은 Lin- 세포를 4°C 및 400 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 3mL의 2x(사이토카인) IMDM 배지 및 3mL의 바이러스 상청액(3.10단계에서 생성됨)을 레트로넥틴 코팅 접시에 재현탁합니다. 접시를 37°C에서 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 6 또는 24시간 동안 인큐베이션한다.
    참고: 본 연구에서 Lin- 세포는 실험 설계에 따라 분류되거나 분류되지 않았습니다.

5. 연속 이식 (그림 1)

참고: 1차 수용자 마우스는 8-10주령의 수컷 C57BL6/J 마우스(CD45.2)였습니다. 그들은 이식 3일 전부터 이식 후 7일까지 기회 소화기 감염을 예방하기 위해 항생제가 포함된 물을 임의 로 제공받았습니다. 일차 수용자 마우스는 이식25시간 전에 준치명(4.75 Gy)을 조사하였다. 이소플루란은 복강내 주사를 맞은 마우스에 적용하지 않았다.

  1. 6 또는 24 h 동안 형질 도입 한 후, 실온 및 400 x g 에서 3 분 동안 원심 분리하여 세포를 수확합니다. 필요한 경우 트립신을 사용하여 접시 바닥에 부착된 세포를 수집합니다. 상청액을 버리고 예열된 PBS에서 세포를 재현탁합니다. 수혜자 수에 따라 PBS의 부피를 결정합니다(즉, 각각 안와후 및 복강내 주사를 받은 수혜자의 경우 0.1mL/마우스 및 0.5mL/마우스).
  2. 치사적으로 조사된 수용자 마우스를 이소플루란 챔버에 넣습니다(산소의 유량은 1.0L/min, 이소플루란의 기화기는 5%로 설정). 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 젖은 연고를 눈에 바르십시오. 마우스는 심장 박동이 분당 60 비트로 떨어지면 추가 절차를 수행 할 준비가됩니다.
  3. 27 G1/2 바늘을 사용하여 1차 수용자 마우스에 역궤도(0.1mL/마우스)7 또는 복강내(0.5mL/마우스)26 에 세포를 주입합니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 얻을 때까지 생쥐를 지속적으로 관찰하십시오. 이식 후 건강을 위해 매일 생쥐를 모니터링하십시오.
  4. 1개월 후, 아래에 설명된 대로 헤마벳에서 전혈구수(CBC)를 평가하여 백혈구 증가증을 모니터링하기 위해 안와후 출혈로 매주 혈액을 수집합니다.
    1. 이소플루란으로 마취 후 마우스를 옆으로 놓습니다(산소의 유량은 1.0L/min, 기화기는 5%로 설정). 마우스는 심장 박동이 분당 60 비트로 떨어지면 추가 절차를 수행 할 준비가됩니다.
    2. 엄지와 검지로 눈을 돌립니다. 내부 안각을 통해 멸균 헤마크리트 모세관으로 정맥동 신경총을 관통합니다.
    3. EDTA 혈액 수집 튜브에 20-25 μL의 혈액을 모으고 눈꺼풀을 닫아 출혈을 멈 춥니 다. 겐타마이신 설페이트 점안액 한 방울을 눈에 바릅니다.
  5. 종점에서 백혈구(WBC)가 4 x 104 cells/μL에 도달하면 마우스를CO2 챔버에서 안락사시키고 대퇴골과 경골을 유동 완충액으로 플러싱하여 골수 세포를 분리한 다음 4단계에서 언급한 대로 RBC 용해.
  6. 종점에서 아래에 언급된 대로 비장세포를 채취합니다.
    1. 마우스를CO2 챔버에서 안락사시킨다. 마우스를 스티로폼 보드의 멸균 수술 패드에 놓고 마우스 발 패드를 통해 다리를 고정합니다. 생쥐의 몸 전체를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
    2. 정중선에서 피부와 근육을 잘라 뾰족한 멸균 가위로 복강을 노출시킵니다. 끝이 뾰족한 멸균 가위로 비장을 분리하고 멸균 15mL 튜브의 유동 완충액에 넣습니다.
    3. 3mL의 유동 완충액이 있는 6cm 접시에 70μm 멸균 여과기를 통해 비장을 메쉬합니다. 세포를 접시로부터 멸균된 15 mL 튜브로 옮기고, 단일 세포 현탁액을 4°C 및 400 x g 에서 3분 동안 원심분리한다.
    4. 상층액을 버리고 5mL의 RBC 용해 완충액에 세포를 재현탁하여 3분 동안 RBC를 용해합니다. 용해를 중지하기 위해 5 mL의 유동 완충액을 첨가하고, 세포 현탁액을 4°C 및 400 x g 에서 3분 동안 원심분리한다.
    5. 70μm 셀 스트레이너를 멸균된 50mL 튜브에 놓습니다. 펠릿을 5mL의 유동 완충액으로 현탁하고 혼합한 다음 세포 여과기를 통과시켜 세포를 수집합니다.
  7. FITC-conjugated anti-mouse CD45.1 항체로 비장세포 및 골수 세포를 염색하고 유세포 분석기에서 검출하여 일차(1°) AML 세포를 식별합니다. 세포는 먼저 FSC-A/FSC-H 및 FSC-A 및 SSC-A에서 게이트되어 단일항을 획득합니다. CD45.1+ 집단은 염색되지 않은 세포와 비교하여 FL1 플롯에서 게이팅됩니다.
  8. 2차(2°) 이식의 경우, 1° r.o. PBS(0.1mL/마우스)의 수혜자로부터 CD45.1 AML 비장 세포를 재현탁하고 CD45.2 수컷 C57BL6/J 마우스에 역궤도 주사합니다. 동시에, PBS(0.5mL/마우스)의 1° ip 수혜자로부터 AML 비장 세포를 재현탁하고 8-12주령의 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 Ai14TdTomato 수컷 마우스27에 복강 주사합니다.
  9. 3차(3°) 이식의 경우 2° IP 수혜자의 골수 또는 복강에서 분리된 AML 세포를 재현탁하고 각각 Ai14TdTomato (RFP+) 또는 CD45.2 마우스에 복강 내 주사합니다. 2° r.o. 수혜자의 복강에서 분리된 AML 세포를 재현탁하고 r.o. Ai14TdTomato (RFP+) 마우스에 주사합니다.
    참고: 2° 이식의 경우 말초 혈액에서 CBC를 모니터링하여 2° 수혜자의 질병 진행을 확인했습니다. AML의 확립을 추가로 확인하기 위해 우리는 골수, 비장 및 간뿐만 아니라 심장 천자에 의한 전체 말초 혈액을 수집했습니다. 또한, i.p. 세포를 수집하기 위해 i.p. 세척을 수행했습니다. 단세포 현탁액은 상기 기재된 바와 같이 골수, 비장, 및 i.p. 세척으로부터 획득하였다. 이들 부위의 세포를 RBC 용해 후 유세포 분석기 상에서 분석하였다. AML 세포는 RFP 음성(RFP-) 세포로 인식되었습니다. 3° 이식을 위해 혈액, 골수, 비장, 간 및 i.p. 종점에서 세포; RFP- 또는 CD45.1+ 세포를 AML 세포로 확인하고 유세포 분석에 의해 검사하였다. 2° 및 3° 수용자 마우스에 방사선 조사 또는 항생제 물을 투여하지 않았습니다.

figure-protocol-1
그림 1: 골수 HSC 및 연속 이식(1°, 2° 및 3°)에서 MLL-AF9 바이러스 형질도입의 개략도. 점선 음영 상자에 표시된 세포 분류기를 사용하여 Sca-1 및 c-Kit 이중 양성 모집단을 분류하는 것은 자원이 허용하는 경우 선택 사항으로 간주됩니다. 이 그림은 BioRender (https://biorender.com/)를 사용하여 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 복강 내 세척

  1. 5mL의 불완전한 IMDM 배지를 복강에 두 번 주입하여 15mL 멸균 튜브에 세포를 수집합니다. 세포 현탁액을 실온 및 400 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 이식 AML 세포(4 x 105 세포/마우스) 2° 수혜자의 복강에서 IP 주사를 통해 3° CD45.2 수용자 마우스(n = 3).

7. 조직학적 분석 28

  1. 안락사 시 비장, 간, 대퇴골을 생쥐로부터 분리합니다. 5mL의 10%(v/v) 완충 포르말린에 고정합니다. 비교를 위해 건강한 사람의 비장과 간을 샘플링합니다.
  2. 고정 된 조직을 파라핀에 넣고 섹션으로 자릅니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염료로 섹션을 염색합니다.
  3. 조직학적 분석을 위해 호환되는 소프트웨어와 함께 설치된 20x 배율의 현미경으로 이미지를 얻습니다.

8. 반정량적 PCR(qPCR) 수행

  1. 제조업체의 지침에 따라 RNA 시약에서 RNA를 준비합니다.
  2. 0.5-1.0 μg RNA를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 cDNA 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
  3. cDNA를 사용하여 qPCR 키트를 사용하여 qPCR을 수행하고 qPCR 시스템에서 샘플을 실행합니다. 사전 검증된 다음 TaqMan 프로브 사용: KMT2A (MLL; 참조 서열: NM_001197104(2), IDT)29 및 18S 리보솜 RNA(Hs99999901_s1).
  4. KMT2A 및 18S 앰플리콘을 2% 아가로스 겔에 로드하여 표현을 시각화합니다. 호환되는 소프트웨어 프로그램과 함께 설치된 이미저에서 이미지를 수집합니다.

9. 데이터 처리

  1. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하고 결과를 SEM± 평균으로 표시합니다. 상업용 일러스트레이터 도구를 사용하여 그림을 생성합니다.

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결과

r.o. 및 i.p.를 이용한 쥐 AML 세포의 이식 효율 비교 이식 경로
이전에는 MLL-AF9-형질도입된 LSK 세포로 안와후 후로 이식된 수용자 마우스에서 1° AML의 확립이 보고되었으며, 연속 이식에 의해 1° AML 세포의 이식 가능성이 입증되었습니다30. 본 연구는 골수 Lin-세포를 사용하여 이식을 수행할 가능성을 평가한 최초의 연구입니다. 비정상적인 백혈구 증가증(그림 2A)의 존재와 골수 및 비장에서 백혈병 세포(CD45.1+)의 침윤 증가(그림 2B)는 골수 Lin-세포를 사용하여 1° AML을 생성하는 타당성을 뒷받침합니다. 질환 유도 기간을 비교하기 위해, 수용자당 2마리의 공여자 마우스를 안락사시켜 LSK 또는 Lin-세포 중 어느 하나를 분리...

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토론

이러한 상술한 연구들은 Lin- 세포의 이식이 1° 쥐 AML의 생성에서 LSK 세포와 비슷하다는 것을 뒷받침하는 증거를 제공한다. 또한, 현재 데이터는 i.p. 주사는 정맥 주사(또는 r.o.) 주사에 비해 쥐 AML을 확립하는 효율적이고 편리한 방법입니다.

LSK 세포 외에도 과립구-단핵구 전구체(GMP), 일반 림프구 전구체(CLP) 및 일반 골수 전구체(CMP)와 같은 다른 집단이 다양한 배양 기간31,32를 갖는 1° MLL-AF9 유도 AML의 생성에서 기증자 세포로 대체되는 것으로 보고되었지만 정량적 비교가 부족하여 최적의 선택을 제안할 수 없습니다. 현재 연구에서, 동일한 기증자 마우스로부터 분리된 Lin- 및 LSK는 형질도입된 골수 전구 세포(Sca-1-)가 AML33...

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공개 사항

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는 적시에 기술 지원을 제공한 Huck Institute의 유세포 분석 핵심 시설과 펜실베니아 주립 대학의 수의학 및 의생명과학부 동물 진단 실험실의 조직병리학 핵심 시설에 감사드립니다. 이 연구는 미국 암 연구소 (KSP), 펜실베니아 주립 농업 과학 대학, 펜실베니아 주립 암 연구소, USDA-NIFA 프로젝트 4771, KSP 및 RFP에 대한 수탁 번호 00000005의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
a-유능한 세포 선택 BiolineBIO-85027
염화암모늄 (NH4Cl)Sigma AldrichCat# A-9434
암피실린Sigma AldrichCat# A0797
소 혈청 알부민 (BSA), 분획 V— 저내독소 등급쌍둥이자리 바이오 제품Cat# 700-102P
Ciprofloxacin HClGoldBio.comCat# C-861-100
DMEM, 고포도당, 글루타민 없음GibcoCat# 11960-044
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (PBS)CorningCat# 21-031-CV
EDTA, 디소듐 염 (EDTA-2Na), 이수화물, 분자 생물학 등급CalbiochemCat# 324503
태아 소 세럼 - 프리미엄 셀렉트애틀랜타 생물학Cat# S11550
홀로-트랜스페린, 소시그마 알드리치Cat# T1283
인슐린 용액 인간시그마Cat# I-9278
Iscove의 수정된 Dulbecco's Medium (IMDM)GibcoCat# 12440-053
L-glutamine 200 mM (100×) 용액HyClone, GelifesciencesCat# SH30034.01
LB 육수, LennoxNEOGENCat #: 7290A
LB 한천 (Miller)이 있는 LB 육수SigmaAldrichCat# L-3147
마우스 anti-mouse CD45.1 (FITC)Miltenyi BiotecCat# 130-124-211
마우스 인터루킨-3 (IL-3)제미니 바이오 제품Cat# 300-324P
마우스 인터루킨-6 (IL-6)제미니 바이오 제품Cat# 300-327P
마우스 줄기 세포 인자 (SCF)제미니 바이오 제품Cat# 300-348P
페니실린-스트렙토마이신 용액, 100x코닝Cat# 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO) 셀ATCCCRL-3214
Potassium Bicarbonate (KHCO3), GranularJT. BakerCat# 2940-01
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)BioLegend 고양이 # 105812
쥐 안티 마우스 Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)BD Pharmingen고양이# 558162
재조합 쥐 Flt3-LigandPepro Tech, INC.Cat# 250-31L
RetroNectin 재조합 인간 피브로넥틴 단편TaKaRaCat# T100A
TransIT-293 시약MirusBioCat# MIR 2705
TRI 시약Sigma AldrichCat# T9424
Trypan Blue Solution, 0.4%GibcoCat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드GibcoCat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichCat# M3148
Commercial Assays 
EasySep 마우스 조혈 전구 세포 분리 키트 StemCell TechnologiesCat# 19856A
고용량 cDNA 역전사 키트 써모 피셔 Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMixQuanta BioCat# 95051-500
플라스미드 맥시 키트 (25)QiagenCat#:12163
Animals
Ai14TdTomato miceJackson LaboratoryStrain # 007914
CD45.1 C57BL6/J 마우스& 주의;잭슨 실험실균주 # 002014
CD45.2 C57BL6/J 마우스 잭슨 실험실균주 # 000664
Instruments and Softwares
Adobe illustrator 버전 25.2.3
BD accuri C6 유세포 분석기BD Biosciences
FlowJo 10.8.0BD
GeneSys 소프트웨어 프로그램 버전 1.5.7.0
GraphPad Prism 버전 6 그래프패드
Hemavet 950FS Drew Scientific
7300 실시간 PCR 시스템응용 바이오시스템
Syngene G:BOX Chemi XR5 화학발광 형광 이미징G:Box Chemi

참고문헌

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