방법 논문

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

DOI:

10.3791/64840

⸱

2023년 6월 23일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 만능줄기세포(hPSC)를 인슐린 분비 베타세포로 분화하면 베타세포 기능 및 당뇨병 치료를 조사할 수 있는 자료가 됩니다. 그러나 인간 베타 세포를 적절하게 모방한 줄기 세포 유래 베타 세포를 얻는 데는 여전히 어려움이 있습니다. 이전 연구를 기반으로 hPSC 유래 섬세포를 생성하여 분화 결과와 일관성이 개선된 프로토콜을 만들었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 1-4단계에서 췌장 전구 키트를 활용한 후 5-7단계에서 2014년에 이전에 발표된 논문에서 수정된 프로토콜(이하 "R-프로토콜"이라고 함)을 사용합니다. 췌장 전구 세포 키트와 400μm 직경의 마이크로웰 플레이트를 사용하여 췌장 전구 세포 클러스터를 생성하는 자세한 절차, 96웰 정적 현탁액 형식의 내분비 분화를 위한 R-프로토콜, hPSC 유래 섬의 체외 특성 분석 및 기능 평가가 포함되어 있습니다. 전체 프로토콜은 초기 hPSC 확장에 1주일이 소요되고 인슐린 생산 hPSC 섬을 얻는 데 ~5주가 소요됩니다. 기본적인 줄기 세포 배양 기술과 생물학적 분석 교육을 받은 직원은 이 프로토콜을 재현할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

췌장 베타 세포는 혈당 수치 상승에 반응하여 인슐린을 분비합니다. 제1형 당뇨병(T1D)1에서 베타세포의 자가면역 파괴로 인해, 또는 제2형 당뇨병(T2D)2에서 베타세포의 기능 장애로 인해, 인슐린 생산이 충분하지 않은 환자는 일반적으로 외인성 인슐린을 투여하여 치료합니다. 생명을 구하는 이 치료법에도 불구하고, 이 치료법은 선의의 베타 세포에서 역동적인 인슐린 분비에 의해 달성되는 혈당의 정교한 조절과 정확하게 일치할 수 없습니다. 따라서 환자는 종종 생명을 위협하는 저혈당 삽화 및 만성 고혈당 여행으로 인한 기타 합병증의 결과로 고통받습니다. 인간 사체 섬의 이식은 T1D 환자의 엄격한 혈당 조절을 성공적으로 회복시키지만, 섬 기증자의 가용성과 이식을 위한 건강한 섬을 정제하는 데 어려움이 있어 제한적이다 3,4. 이 문제는 원칙적으로 hPSC를 대체 출발 물질로 사용하여 해결할 수 있습니다.

in vitro에서 hPSC로부터 인슐린 분비 섬을 생성하는 현재의 전략은 종종 in vivo 5,6에서 배아 췌장 발달 과정을 모방하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해서는 책임 있는 신호 전달 경로에 대한 지식과 발달 중인 배아 췌장의 중요한 단계를 모방하기 위해 해당 용해성 인자의 시간 제한 추가가 필요합니다. 췌장 프로그램은 전사 인자 포크헤드 박스 A2(FOXA2)와 성별 결정 영역 Y-박스 17(SOX17)7로 표시된 최종 내배엽에 대한 헌신으로 시작됩니다. 최종 내배엽의 연속적인 분화는 원시적인 장관의 형성을 포함하며, 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1)7,8,9을 발현하는 후방 앞창자로의 패턴화, PDX1 및 NK6 호메오박스 1(NKX6.1)10,11을 함께 발현하는 췌장 전구세포로의 상피 확장을 포함합니다.

내분비 섬 세포에 대한 추가적인 노력은 내분비 마스터 조절인자인 neurogenin-3 (NGN3)12의 일시적인 발현과 주요 전사 인자인 neuronal differentiation 1 (NEUROD1) 및 NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13의 안정적인 유도를 동반합니다. 인슐린 생산 베타 세포, 글루카곤 생성 알파 세포, 소마토스타틴 생산 델타 세포 및 췌장 폴리펩티드 생산 PPY 세포와 같은 주요 호르몬 발현 세포는 이후에 프로그래밍됩니다. 이러한 지식과 광범위한 고처리량 약물 스크리닝 연구의 발견을 통해 최근의 발전으로 인슐린 분비 14,15,16,17,18,19가 가능한 베타 세포와 유사한 세포를 가진 hPSC 섬을 생성할 수 있게 되었습니다.

포도당 반응성 베타 세포 6,14,18,19를 생성하기 위한 단계적 프로토콜이 보고되었습니다. 이러한 연구를 기반으로 구축된 본 프로토콜은 평면 배양에서 PDX1+/NKX6.1+ 췌장 전구 세포를 생성하기 위한 췌장 전구 세포 키트를 사용한 다음, 균일한 크기의 클러스터로 마이크로웰 플레이트 응집과 정적 3D 현탁 배양에서 R-프로토콜을 사용하여 인슐린 분비 hPSC 섬에 대한 추가 분화를 포함합니다. 유세포 분석, 면역염색 및 기능 평가를 포함한 품질 관리 분석은 분화 세포의 엄격한 특성 분석을 위해 수행됩니다. 이 백서는 유도 분화의 각 단계에 대한 자세한 설명을 제공하고 in vitro 특성화 접근법을 간략하게 설명합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 피더가 없는 조건에서 H1, HUES4 PDXeG 및 Mel1 INSGFP/W를 포함한 hPSC 라인과의 작업을 기반으로 합니다. 단계별 절차는 대표 결과 섹션에서 Mel1 INSGFP/W 의 차별화를 지원하는 데이터와 함께 이 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. 여기에 명시되지 않은 다른 hPSC 라인으로 작업할 때는 추가 최적화가 필요한 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약 및 용액과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 차별화 배지 및 용액 준비

참고: 준비할 모든 용액에 대해서는 표 1 을 참조하고 차별화 매체에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.

  1. 세포 배양을 위한 모든 배지와 시약을 멸균 생물 안전 작업대에서 준비합니다. 사용하기 전에 세포 배양 관련 용액과 기초 배지를 수조에서 37°C로 간단히 예열합니다.
    참고: 아래 설명과 같이 보충제를 추가하여 매일 신선한 차별화 배지를 만들고 당일에 사용하십시오. 또는 췌장 전구 키트는 제조업체의 프로토콜에 따라 며칠 동안 사용할 수 있는 더 큰 부피를 미리 준비할 수 있는 옵션을 제공합니다. 배지 준비를 위한 두 가지 방법 모두 잘 작동하는 것으로 입증되었습니다. 수조에 미디어를 장기간 방치하지 않는 것이 좋습니다. 매일 신선한 배지를 준비할 때 반복적인 동결-해동 주기를 피하기 위해 보충제를 분주하는 것이 좋습니다.

2. hPSC를 췌장 전구세포로 분화

  1. mTeSR1 complete 배지에서 Matrigel 코팅 용기에서 미분화 hPSC를 유지하고 매일 배지 교체를 수행합니다. 유지 배양 중에 세포가 제조업체의 프로토콜에 따라 세포 해리 시약을 사용하여 ~70% 밀도에 도달하면 3-4일마다 hPSC를 통과시킵니다. 분화를 시작하려면 세포를 단일 세포로 해리하고 6웰 또는 12웰 조직 배양 처리 플레이트(웰당 배지 부피가 각각 2mL 또는 1mL)에 파종합니다.
    참고: 내배엽 기저 배지 및 그 부분 표본의 보관과 관련된 지침은 표 1 을 참조하십시오.
  2. hESC 인증 Matrigel(제조업체 프로토콜에서 권장하는 대로 얼음처럼 차가운 DMEM/F12로 희석)로 배양 웰을 사전 코팅하고 플레이트를 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
  3. Matrigel 코팅 플레이트를 실온으로 옮깁니다(3시간 이내 사용).
  4. hPSC 배양액에서 사용한 배지를 흡인하고 DPBS로 한 번 헹굽니다. hPSC 배양을 37°C에서 3-5분 동안 세포 해리 효소를 사용하여 단일 세포로 해리합니다. 따뜻한 DMEM/F12 배지를 추가하여 세포를 헹구고 15mL 또는 50mL 코니컬 튜브에 옮기고 300× g 에서 5분 동안 회전시킵니다.
  5. 줄기 세포 완전 배지와 10μM Y-27632로 세포 펠릿을 재현탁시키고 혈구계 또는 자동 세포 카운터로 살아있는 세포(트리판 블루 음성) 계수를 수행합니다. 희석된 Matrigel을 흡인하고 즉시 Matrigel 코팅 웰에 1.60-1.80 × 10 5/cm2의 밀도로 살아있는 세포를 파종하고 가습된 37°C,5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 1단계로 진행합니다.
    참고: 이로 인해 미화를 시작하기 위한 ~95%의 시작 밀도가 발생합니다. 제조업체의 프로토콜에 따르면 2.6 × 105/cm2 의 파종 밀도가 권장됩니다. 세포주에 대한 최적 값을 결정하고 세포 생존율을 확인하기 위해 다양한 파종 밀도를 테스트하는 것이 좋습니다. 생존율이 80% 미만이면 분화를 진행하지 마십시오. 낮은 세포 생존율은 수확 중 과소화 또는 과분쇄의 결과이거나 파종 전에 DMEM/F12 배지에 세포를 장기간 방치한 결과일 수 있습니다.
  6. 1단계 1일차에 내배엽 기저 배지를 욕조에서 37°C로 잠시 데우고 보충 MR 및 CJ를 해동합니다. 내배엽 기저 배지에 Supplement MR 및 CJ를 첨가하여 Stage 1A 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  7. 사용한 배지를 웰에서 흡인하고 Stage 1A 배지를 추가하고 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
    알림: 세탁 단계는 필요하지 않습니다. 배지 교환 전에 배양 플레이트를 부드럽게 흔들어 배양액에서 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 매체를 제거하는 동안 피펫 팁을 웰 바닥에 접촉하지 않고 부드러운 배지 첨가를 통해 단층을 방해하지 마십시오.
  8. Stage 1 2일차, 37°C 수조에서 내배엽 기저 배지를 잠시 데우고 Supplement CJ를 해동합니다. 내배엽 기저 배지에 Supplement CJ를 첨가하여 1B기 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  9. 사용한 배지를 웰에서 흡입하고 Stage 1B 배지를 추가하고 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
  10. 스테이지 1 3일차에서 2.8-2.9단계를 반복합니다. 2단계로 진행합니다.
  11. 2단계 1일차, 37°C 욕조에서 췌장 2-4단계 기초 배지를 데우고 보충제 2A 및 2B를 해동합니다. 보충제 2A 및 2B를 췌장 2-4단계 기초 배지에 추가하여 2A 단계 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  12. 사용한 배지를 웰에서 흡입하고 Stage 2A 배지를 추가하고 가습된 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
  13. 2단계 2일차, 췌장 2-4단계 기초 배지를 37°C 욕조에서 데우고 보충제 2B를 해동합니다. 췌장 2-4단계 기초 배지에 보충제 2B를 첨가하여 2B 단계 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  14. 사용한 배지를 웰에서 흡입하고 Stage 2B 배지를 추가하고 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
  15. 스테이지 2 3일차에서 2.13-2.14단계를 반복합니다. 3단계로 진행합니다.
  16. 3단계 1일차, 췌장 2-4단계 기초 배지를 37°C 욕조에서 따뜻하게 하고 보충 3을 해동합니다. 췌장 2-4단계 기초 배지에 보충제 3을 추가하여 3단계 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  17. 사용한 배지를 웰에서 흡입하고 Stage 3 배지를 추가하고 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
  18. 스테이지 3 2일차와 3일차에서 2.16-2.17단계를 반복합니다. 4단계로 진행합니다.
  19. 4단계 1일차, 췌장 2-4단계 기초 배지를 37°C 욕조에서 따뜻하게 하고 보충 4를 해동합니다. 췌장 2-4단계 기초 배지에 보충 4를 추가하여 4단계 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  20. 사용한 배지를 웰에서 흡입하고 Stage 4 배지를 추가한 다음 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
  21. 스테이지 4 2일차부터 4일차까지 2.19-2.20단계를 반복합니다. 집계 단계로 진행합니다.

3. 400μm 직경의 마이크로웰 플레이트를 사용하여 췌장 전구 세포로 응집

  1. 스테이지 4 5일차에는 마이크로웰(예: 24웰 플레이트 형식)을 웰당 500μL의 접착 방지 헹굼 용액으로 전처리합니다.
  2. 밸런스 플레이트를 준비하고 마이크로웰 플레이트를 1,300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    알림: 현미경으로 플레이트를 확인하여 마이크로웰에 기포가 남아 있지 않은지 확인합니다. 기포가 마이크로웰에 갇혀 있는 경우 다시 5분 동안 원심분리합니다.
  3. 웰에서 부착 방지 헹굼 용액을 흡입하고 DPBS 1mL로 한 번 헹굽니다. 웰에서 DPBS를 흡인하고 각 웰에 1mL의 응집 배지를 추가합니다.
  4. 췌장 전구 배양물에서 사용한 배지를 제거하고 DPBS로 한 번 세척합니다. 37°C에서 10-12분 동안 해리 시약을 사용하여 배양액을 단일 세포로 해리합니다. 따뜻한 DMEM/F12로 세포를 헹구고 튜브에 옮기고 300× g 에서 5분 동안 회전시킵니다.
  5. 응집 배지에 세포 펠릿을 재현탁시키고 살아있는 세포 계수를 수행합니다. 웰당 총 240만 개(즉, 마이크로웰당 2,000-3,000개 세포)를 시드하고 각 웰에 응집 배지를 추가하여 웰당 2mL의 최종 부피를 얻습니다.
  6. P1000 피펫 팁으로 세포를 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 웰 전체에 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 마이크로웰에 기포를 도입하지 마십시오. 마이크로웰 플레이트를 300× g 에서 5분 동안 원심분리하여 마이크로웰의 세포를 캡처합니다. 24시간 응집을 위해 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 마이크로웰 플레이트를 배양하고 5-7단계 분화를 진행합니다.
    알림: 집계 시 플레이트를 방해하지 않도록 주의하십시오. 최적의 응집체 형성을 위해 최대 48시간의 배양 시간이 필요할 수 있습니다.

4. 키트 유래 췌장 전구 클러스터를 hPSC-섬으로 분화

  1. 5일째 1일차, 37°C 수조에서 Stage 5-7 기초 배지를 데우고 보충제를 해동합니다(표 1 및 표 2 참조). Stage 5-7 기초 배지에 보충제(최종 작업 농도까지)를 추가하여 Stage 5 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  2. 응집체 형성 후 P1000 피펫 팁으로 응집체를 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 응집되지 않은 세포를 띄웁니다. 응집체가 중력에 의해 가라앉도록 합니다(~1분 동안 대기). 흡인 응집체를 피하면서 사용한 배지(부유 응집되지 않은 세포 포함)를 가능한 한 많이 웰에서 부드럽게 제거합니다.
  3. 새로운 Stage 5 배지를 마이크로웰 플레이트 표면에 세게 분사하여 마이크로웰에서 응집체를 제거합니다. 응집체를 초저 부착(ULA) 6-웰로 옮깁니다. Stage 5 배지로 한 번 헹구면 마이크로웰에서 응집체를 완전히 회수할 수 있습니다.
  4. ULA 6-웰에서 모든 응집체를 수집하고, 5단계 배지에서 응집체를 재현탁하고, 밀도를 100μL당 20개의 클러스터로 조정합니다(예: 각 웰에서 ~1,200개의 클러스터가 검색될 것으로 예상됨). Stage 5 배지 6mL에 1,200개의 클러스터를 재현탁시킵니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 50μL의 Stage 5 배지를 ULA 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 모서리 및 가장자리 웰을 200μL의 DPBS로 채웁니다.
    알림: 골재 배양에 가장자리 우물은 더 많이 증발하기 쉬우므로 사용하지 마십시오. 그렇지 않으면 가장자리를 따라 증발을 최소화하도록 설계된 96웰 플레이트(예: 해자가 내장된 96웰 플레이트)를 사용하거나 배양 플레이트를 습도가 높은 미기후 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.
  5. 100μL의 클러스터 재현탁액을 ULA 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 추가하면 웰당 평균 20개의 클러스터를 포함하는 총 150μL 배양 배지가 생성됩니다.
    알림: 96-웰에 분배하기 전에 매번 클러스터 재현탁액을 부드럽게 혼합하십시오.
  6. 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 평평한 표면에 배양 플레이트를 놓습니다.
  7. 5단계 2일차에서 4.1단계에 따라 5단계 매체를 준비합니다.
  8. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 ~90μL의 사용된 배지를 제거하고 100μL의 Stage 5 배지로 리프레시합니다.
  9. 5일차 3일차에서 4.7-4.8단계를 반복합니다. 6단계로 진행합니다.
  10. Stage 6 Day 1, 37°C 수조에서 Stage 5-7 기초 배지를 데우고 보충제를 해동합니다(표 1 및 표 2 참조). Stage 5-7 기초 배지에 보충제(최종 작업 농도까지)를 추가하여 Stage 6 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  11. 멀티채널 피펫을 사용하여 사용한 배지의 ~90μL를 제거하고 웰당 100μL의 Stage 6 배지로 리프레시합니다.
  12. 스테이지 6 2일차부터 8일차까지 4.10-4.11단계를 반복합니다. 스테이지 7로 진행합니다.
  13. 7일째 1일째, 37°C 수조에서 Stage 5-7 기초 배지를 데우고 보충제를 해동합니다(표 1 및 표 2 참조). Stage 5-7 기초 배지에 보충제(최종 작업 농도까지)를 추가하여 Stage 7 배지를 준비합니다. 잘 섞어서 바로 사용하십시오.
  14. 멀티채널 피펫을 사용하여 사용한 배지의 ~90μL를 제거하고 웰당 100μL의 Stage 7 배지로 리프레시합니다.
  15. 스테이지 7 2일차부터 12일차까지 4.13-4.14단계를 반복합니다. in vitro 특성 분석을 진행합니다.

5. 유세포 분석

  1. 배양 배지를 제거하고 DPBS로 한 번 세척합니다. 해리 시약을 사용하여 배양물(평면 전구 세포 또는 분화 클러스터)을 37°C에서 10-12분 동안 배양하여 단일 세포로 해리합니다. FACS 버퍼로 헹구고 300× g 에서 5분 동안 회전합니다.
  2. 세포 펠릿을 FACS 완충액에 재현탁시키고 세포 계수를 수행합니다. 300× g 에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 실온에서 10분 동안 500μL의 Fix/Perm 완충액에 단일 세포를 재현탁시킵니다.
    알림: 사용하기 전에 Fix/Perm 버퍼를 실온에 두십시오. Fix/Perm 완충액에는 파라포름알데히드(PFA)가 포함되어 있습니다. PFA를 흄 후드에서 조심스럽게 취급하고 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
  3. 500 × g 에서 3분 동안 탈수하고 500μL의 1x Perm/Wash 완충액으로 두 번 세척한 다음 300μL의 1x Perm/Wash 완충액으로 재현탁합니다. 100μL의 단일 세포 재현탁액(각각 2.5-3 × 105 개 세포 포함)을 3개의 미세분리 튜브로 전달하여 염색되지 않은 대조군, 등형 대조군 및 항체 염색을 수행합니다(샘플 항체 및 희석 정보는 재료 표 참조). 실온에서 45분 동안 배양하고 호일로 덮습니다.
  4. 500× g 에서 3분간 회전합니다. 500μL의 1x Perm/Wash 완충액으로 두 번 세척합니다. 100μL의 FACS 완충액에 샘플을 재현탁시키고 유세포 분석기 및 소프트웨어(예: FlowJo)를 사용하여 염색된 세포를 분석합니다(특정 단계에서 마커의 세포 내 염색을 위한 재료 표 참조).
    참고: 샘플을 즉시 분석하지 않으면 빛으로부터 보호된 4°C에서 보관하십시오. 게이팅 전략의 경우, 유동 데이터는 먼저 작은 세포 파편을 제거하기 위해 산란 특성(FSC-A 및 SSC-A)에 의해 게이팅된 다음 단일항을 식별하기 위해 FSC-A 및 FSC 너비 특성으로 제어됩니다. 양성 및 음성 게이팅은 줄기 세포 대조군 및/또는 염색되지 않은 동형 대조군에 의해 결정됩니다.

6. 전체 마운트 면역염색

  1. 마이크로퓨지 튜브에서 클러스터를 수집합니다. 중력에 의해 군집을 정착시킵니다. 사용한 배지를 흡인하고 PBS 1mL(칼슘 및 마그네슘 포함)로 한 번 헹굽니다. 밤새 4°C에서 4% PFA 1mL로 클러스터를 고정합니다.
  2. PBST로 한 번 헹구고 틸트 셰이커에서 최소 6시간 동안 주변 온도의 마이크로프리즈 튜브에 0.3% TritonX-100 500μL로 20-30개의 클러스터를 투과시킵니다.
    참고: 대규모 클러스터의 경우 더 긴 투과화 시간(최대 24시간)이 필요합니다.
  3. tilt shaker에서 1시간 동안 상온에서 100μL의 차단 완충액에 클러스터를 배양합니다. 차단 완충액을 제거하고 100μL의 1차 항체를 항체 희석 완충액에 희석하여 틸트 셰이커에서 상온에서 밤새 클러스터를 배양합니다.
    참고: 이미징 중 배경이 강하면 4°C에서 1차 항체로 배양합니다.
  4. 틸트 셰이커에서 500μL의 PBST로 3 x 30분 동안 완전히 세척합니다(틸트 각도는 8로 설정, 속도는 20으로 설정).
  5. 100μL의 2차 항체가 있는 클러스터를 상온의 항체 희석 완충액에 넣어 틸트 셰이커에서 밤새 배양합니다. 튜브를 호일로 덮습니다.
    참고: 이미징 중 배경이 강하면 4°C에서 2차 항체로 배양합니다.
  6. 500μL의 PBST로 한 번 헹굽니다. 100μL의 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 용액(PBST에서 10μg/mL)을 추가하고 상온에서 10-15분 동안 염색합니다. 호일로 덮고 빛으로부터 보호하십시오.
  7. 틸트 셰이커에서 500μL의 PBST로 3 x 30분 동안 철저히 세척합니다. 세척 단계에서 튜브를 호일로 덮으십시오.
  8. 클러스터를 이미징 챔버 슬라이드(재료 표 참조)에 부착하고, 제조업체의 프로토콜 및 공개된 프로토콜20,21에 따라 조직 접착제로 사전 코팅합니다.
  9. 조직 투명화 매체(PBS 용액의 80% 글리세롤)로 장착하고 유리 커버슬립으로 덮습니다. 컨포칼 이미징까지 빛으로부터 보호하십시오.
    알림: 샘플이 즉시 이미징되지 않으면 빛으로부터 보호된 4°C에서 보관하십시오.

7. 정적 GSIS 분석

  1. 37°C 수조에 저포도당 크렙 링거 중탄산염(3.3G KRB) 완충액, 고포도당(16.7G) KRB 완충액 및 30mM KCl KRB 완충액을 데우십시오.
  2. 크기에 맞는 클러스터를 직접 선택하고 따뜻한 3.3G KRB 완충액 2mL로 헹굽니다. 클러스터를 비조직 배양 처리된 6웰 플레이트로 옮기고 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 2mL o 따뜻한 3.3G KRB 완충액에서 1시간 동안 평형을 이룹니다.
  3. 평형 후 분석 챔버( 재료 표 참조)를 100μL의 따뜻한 3.3G KRB 버퍼로 채웁니다. 5개의 클러스터를 손으로 선택하여 분석 챔버의 중앙으로 옮깁니다. 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 10 μL 피펫 팁을 사용하여 최소 중간 부피로 클러스터를 이송하십시오.
  4. 상층액의 ~100μL를 조심스럽게 수집하고 기저 인슐린 분비가 측정될 때까지 -30°C에서 보관합니다(단계 7.9 참조). 이 단계에서 클러스터를 건조시키거나 손실하지 마십시오. 즉시 100μL의 따뜻한 16.7G KRB 완충액을 분석 챔버에 추가하고 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 동일한 클러스터를 30분 동안 배양합니다.
  5. 상층액의 ~100μL를 조심스럽게 수집하고 포도당 자극 인슐린 분비가 측정될 때까지 -30°C에서 보관합니다(단계 7.9 참조). 즉시 100μL의 따뜻한 30mM KCl KRB 완충액을 분석 챔버에 추가하고 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 동일한 클러스터를 30분 동안 배양합니다.
  6. 상층액의 ~100μL를 조심스럽게 수집하고 KCl 자극 인슐린 분비가 측정될 때까지 -30°C에서 보관합니다(7.9단계 참조). 즉시 100μL의 RIPA 용해 완충액을 분석 챔버에 추가하고 5개의 클러스터가 모두 포함된 용해 완충액을 미세분리 튜브로 옮깁니다.
  7. 선택 사항) P200 피펫 팁으로 격렬한 분쇄로 클러스터를 수동으로 분해합니다. 30초 동안 소용돌이를 일으키고 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음 30초 동안 소용돌이를 일으킵니다.
    알림: 소용돌이를 통해 완전한 용해와 얼음 위에서 충분한 배양 시간을 보장합니다.
  8. 8,000× g 에서 1분간 회전합니다. 상층액을 수집하고 총 인슐린 함량이 측정될 때까지 -30°C에서 보관합니다(단계 7.9 참조).
  9. 제조업체의 프로토콜 및 게시된 프로토콜20,22에 따라 인간 인슐린 ELISA 키트를 사용하여 상층액 샘플에서 인간 인슐린을 측정합니다.
    알림: 상층액의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오.amp르. 동결-해동 주기가 3회 이상인 샘플은 분석해서는 안 됩니다.

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결과

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우리는 줄기세포를 7단계로 인슐린 분비 hPSC-섬으로 분화하는 하이브리드 전략을 개발했으며, 평면 배양의 처음 4단계에서는 췌장 전구 키트를 활용한 다음, 마지막 3단계에서는 정적 현탁 배양에서 이전에 보고된 방법6을 기반으로 구축된 수정된 프로토콜을 사용합니다(그림 1). 이 프로토콜을 사용하면 세포 파종 후 24시간(0단계)에 거의 밀도(90%-100%) 배양을 보장하는 것이 대부분의 hPSC 라인에 대한 효율적인 분화를 시작하는 데 매우 중요합니다(그림 2A). 특정 세포주에 대한 최적의 조건을 결정하기 위해 다양한 파종 밀도를 테스트하는 것이 좋습니다. 1단계 배양 중에는 부유하는 죽은 세포로 인해 배지가 뿌옇게 보일 수 있으며, 이는 이 단계에서 일반적으로 관찰됩니다. 이것은 부착된 세포가 용기 표면을 완전히 덮는 한 키트의 분화 효율성을 손상시키지 않습니다. 2-4단계...

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토론

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이 논문은 체외 배양 후 40일 이내에 포도당 챌린지 시 인슐린을 분비할 수 있는 hPSC 섬을 생성할 수 있는 7단계 하이브리드 프로토콜을 설명합니다. 이러한 여러 단계 중에서, 최종 내배엽의 효율적인 유도는 최종 분화 결과(18,27,28)를 위한 중요한 출발점을 설정하는 것으로 여겨진다. 제조업체의 프로토콜에서는 분화를 시작하기 위해 2.6 × 105/cm2의 파종 밀도를 권장하며 세포는 2일 동안 1단계 배지에 노출됩니다. 세포가 1일차(90%-100%)에 거의 근접하도록 하려면 최적의 파종 밀도가 다를 수 있으므로 새로운 hPSC 라인에서 작업할 때 파종 밀도를 테스트하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 3개의 hPSC 라인을 모두 테스트한 결과, 2.60 × 105/cm2가 아닌 1...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

티모시 J. 키퍼(Timothy J. Kieffer)는 이 원고를 준비하는 동안 ViaCyte의 직원이었습니다. 다른 저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF 및 Canadian Institutes of Health Research의 지원에 감사드립니다. Jia Zhao와 Shenghui Liang은 Michael Smith Health Research BC Trainee Award를 수상했습니다. 미첼 J.S. 브람(Mitchell J.S. Braam)은 Mitacs Accelerate Fellowship의 수혜자입니다. Diepiriye G. Iworima는 Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship과 CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award를 수상했습니다. Mel1 INS GFP/W 라인과 앨버타 당뇨병 연구소 아일렛 코어(Alberta Diabetes Institute Islet Core)를 공유해 주신 MCRI와 Monash University의 Edouard G. Stanley 박사님께 진심으로 감사드립니다. 또한 브리티시 컬럼비아 대학교(University of British Columbia)의 생명과학 연구소(Life Sciences Institute) 이미징 및 유세포 분석 시설의 지원에도 감사드립니다. 그림 1 은 BioRender.com 로 작성되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397갑상선 호르몬
4% PFA 용액Santa Cruz Biotechnologysc-281692흄 후드
96-Well, Ultralow Attachment, Flat BottomCorning Costar (VWR)CLS3474Flat bottom에서 처리해야 합니다. 마지막 3단계의 정적 현탁액 배양을 위해
AccutaseSTEMCELL Technologies079204기 세포용 해리 시약
Aggrewell400 플레이트STEMCELL Technologies34415400 µ m 직경 마이크로웰 플레이트
Aggrewell800 플레이트STEMCELL Technologies34815800 &마이크로; m 직경 마이크로 웰 플레이트
Alexa Fluor 488 염소 안티 휴먼 FOXA2 (염소 IgG)R & D SystemsIC2400G1:100 in 유세포 분석; 1단계 세포 분석에 사용
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR& D SystemsIC108G1:100 in 유세포 분석
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in 유세포 분석; 7단계 세포 분석에 사용
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR& D SystemsIC0041G1:500 in 유세포 분석
Alexa Fluor 647 마우스 anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2,000 in flow cytometry; 7단계 세포 분석에 사용됨
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 in 유세포 분석
Alexa Fluor 647 마우스 anti-Human NKX6.1 (마우스 IgG1κ)BD Sciences563338유세포 분석에서 1:33; 4 단계 세포
Alexa Fluor 647 마우스 안티 휴먼 SOX17 (마우스 IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; 1단계 세포 분석에 사용됨
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ 이소타입 컨트롤BD 과학5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-beta 신호 억제제
항부착 헹굼 용액 STEMCELL Technologies7010마이크로웰 헹굼 용액
분석 챔버CellvisD35-10-1-N정적 GSIS 및 컨포칼 이미징 목적
소 혈청 알부민(BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100면역염색 절차용
CK19 항체DAKOM08881:50 전체 마운트 면역형광
D-포도시그마G8769중간 보충
DAPI시그마D9542핵 counterstaining
DMEM / F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032매트릭스 희석 용액
당나귀 안티 염소 Alexa Fluor 555Life technologiesA214321 : 500 전체 마운트 면역 형광
당나귀 안티 염소 Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 전체 마운트 면역 형
당나귀 안티 마우스 Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 전체 마운트 면역 형광
당나귀 안티 마우스 Alexa Fluor 647라이프 테크놀로지A315711:500 전체 마운트 면역 형광
당나귀 안티 토끼 Alexa Fluor 555라이프 테크놀로지A315721:500 전체 마운트 면역 형광
당나귀 안티 토끼 Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 전체 마운트 면역 형광
당나귀 안티 양 Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 전체 마운트 면역 형광
DPBSSigmaD8537Ca2+ 및 Mg2+
ELISA, 인슐린, 인간Alpco80-INSHU-E01.1인체 인슐린 측정용
지방산이 없는 BSAProliant68700배지 보충제
고정 및 투과화 솔루션 키트BD Sciences554714Fix/Perm 및 10x Perm/Wash 솔루션 포함
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies7174유지 배양 중 덩어리 패시징 hPSC용
글루카곤 항체SigmaG26541:400 전체 마운트 면역형광
GLUT1 항체Thermo Fisher ScientificPA1-377821:200 전체 마운트 면역형광
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-글루타민 보충제
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4조직 세척 및 장착용
GSi XXSigma Millipore565789Notch 억제제
HeparinSigmaH3149중간 보충제
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민; 중간 보충제
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP 길항제
MAFA 항체Abcamab264051:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC 인증Thermo Fisher Scientific08-774-552혈관 표면 코팅용 세포 외 매트릭스
MCDB131 매체Life Technologies10372019Base medium
mTeSR1 Complete KitSTEMCELL Technologies85850줄기 세포 배지 및 5x 보충제 포함
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165항산화
NaHCO3SigmaS6297배지 보충제
NEUROD1 항체R & D SystemsAF27461:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 항체DSHBF55A12-c1:50 in whole mount immunofluorescence
췌장 폴리펩티드 항체R& D SystemsAF62971:200 in whole mount immunofluorescence
PBSSigmaD8662with ca2+ and Mg2+
PDX1 항체Abcamab472671:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 유세포 분석; 7단계 세포
PE 마우스 anti-Human NKX6.1 (마우스 IgG1k)BD Sciences5630231:250 in 유세포 분석
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BD Sciences5621611:200 in flow cytometry; 4단계 세포
PE Mouse IgG1&kappa 분석에 사용; Isotype ControlBD Sciences5546801:2,000 in 유세포 분석
PE mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)BD Sciences5645631:200 in flow cytometry
R428 Cayman Chemicals21523AXL 티로신 키나아제 억제제
레티노이드산, all-transSigmaR2625감광성
RIPA 용해 완충액, 호르몬 추출용 10xSigma20-188
SANT-1SigmaS4572SHH 억제제
SLC18A1 항체SigmaHPA0637971:200 전체 마운트 면역형광
소마토스타틴 항체SigmaHPA0194721:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor KitSTEMCELL Technologies05120Basal media and supplements included
Synaptophysin antibodyNovusNB120-166591:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100SigmaX100For per메eabilization
트롤록스 Sigma Millipore648471비타민 E 아날로그
TrypLE Enzyme ExpressLife 기술12604-021단일 세포 통과 hPSC용 세포 해리 효소 시약
Trypsin1/2/3 항체R& D SystemsAF35861:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK 억제제
황산아연SigmaZ0251매체 보충제
, 분석에 사용됩니다.당 광 ,

참고문헌

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