쥐 하악 어금니 추출 소켓 치유 모델 구축

발치 후 소켓 치유는 일반적인 임상 시나리오로, 바람직하지 않은 치유 하에서 소켓 출혈, 드라이 소켓, 심지어 턱 골수염과 같은 바람직하지 않은 합병증을 초래할 수 있다 ^1,2,3. 이러한 동반 질환은 환자의 삶의 질을 저하시킬 수 있으며, 더 나쁜 것은 대규모 뼈 손실로 인한 보철 재활에 심각한 어려움을 줄 수 있습니다⁴. 소켓 치유 단계가 해명되었지만 다양한 예후 문제에 직면했을 때 발치 후 임상 치료를 지시하기에는 부적절합니다⁴.

소켓 치유 과정의 기본 메커니즘을 더 잘 이해하고 위의 상황을 피하기 위해 동물 모델을 기반으로 한 여러 연구가 수행되었습니다. Sp7은 골격 발달, 뼈 지혈 및 뼈 재생에 중요한 역할을 하는 조골세포 분화의 마스터 조절제입니다 ^5,6. 합리적인 소켓 치유 모델은 뼈 재생에서 외상 후 Sp7의 중복성을 표시할 수 있습니다. 또한, 장골 골절 치유와는 달리, 단 하나의 골형성 과정, 막내 골화만이 추출 소켓⁽⁷)의 치유 과정을 수반한다. 따라서 임플란트 골유착은 동일한 골형성 규칙을 따르기 때문에 동물 치아 발치 모델은 임플란트 기반 치료법을 연구하는 데 최적입니다⁸.

수십 년 동안 치아 추출 모델은 쥐, 토끼 및 개에서 수행되었는데, 그 이유는 이들 종은 ^9,10,11에서 작동하기에 편리한 큰 이빨을 가지고 있기 때문입니다. 그러나 유전자 변형에 대한 요구가 증가하고 인간에 대한 보다 적응력이 뛰어난 유전적 배경을 감안할 때 마우스는 치아 추출 모델을 확립하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그 후, 연구자들은 표현형만을 관찰하는 대신 게놈 변형 마우스를 사용하여 소켓 치유 과정에서 특정 세포 집단의 역할을 밝힐 수 있었다¹². 쥐 치아 발치 소켓 모델 중 선행 연구는 쥐 상악 치아 및 앞니 발치 소켓의 확립 및 치유 과정을 입증했습니다^13,14,15,16. 그러나 예후의 치유 패턴과 탐정 및 관찰 시점은 프로토콜에 따라 다를 수 있습니다. 이것은 학자들이 쥐 소켓 치유 모델을 확립하는 보편적인 기준에 호소합니다.

이 연구는 위의 문제에 대해 실행 가능한 쥐 소켓 치유 모델을 구성하는 것을 목표로 했습니다. 생쥐의 하악 어금니는 상악 어금니 및 앞니에 비해 독특한 형태학적 특성을 가지고 있어 고유한 장점과 단점을 가지고 있습니다. 쥐 하악에 초점을 맞춘 모델이 현재 진공 기반이기 때문에 이 프로토콜은 생쥐에서 하악 제1대구치를 추출하는 성공적인 방법을 제공하려고 했습니다. 우리는 이 프로토콜이 소켓 치유의 기본 메커니즘을 밝히고 임상 치료를 나타내기 위한 새로운 아이디어로 기초 연구자들을 계몽하기를 바랍니다.

이 연구의 모든 동물 절차는 쓰촨 대학교 서중국 구강학 윤리 위원회(WCHSIRB-D-2017-041)에서 검토하고 승인했습니다. 상업적 공급원으로부터 입수한 성인 C57BL/6 마우스( 재료 표 참조)를 본 연구에 사용하였다.

1. 수술 전 준비

1. 기구 준비
   1. 엘리베이터로 사용할 다양한 일회용 주사기 바늘(26G, 25G, 23G, 재료 표 참조)을 준비합니다. 그림 20과 같이 바늘 머리를 약 40°-1° 굴절시킵니다.
   2. 집게로 톱니 안과 핀셋을 준비하십시오. 생쥐의 어금니 크기에 맞고 어금니를 단단히 잡을 수 있는지 확인하십시오. 이상적인 핀셋 크기는 그림 1A, B3에 나와 있습니다.
   3. 입 오프너로 사용할 고무 밴드(의료용 라텍스 장갑에서 찢을 수 있음), 수술 플랫폼으로 폼 보드 또는 코르크판, 수술 부위를 밝히는 헤드램프, 수술 후 부흥을 위한 가열 패드를 구하십시오. 마른 면봉을 작은 조각으로 찢어 시술 중 출혈이 발생하면 수술 부위에 바릅니다.
2. 마취 준비
   1. 마우스는 '발가락 꼬집기' 방법을 통해 확인된 전신 마취를 달성하는 임의의 적절한 마취 프로토콜에 의해 마취될 수 있다. 마취 후 마우스의 눈에 수의학 연고를 바르십시오.
      참고: 바람직한 전신 마취 프로토콜은 다음과 같을 수 있습니다: 자일라진(10mg/kg) 및 케타민(100mg/kg)을 복강내(IP)로 유도 및 유지;
      이 연구를 위해 이소플루란과 1% 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg, IP)을 마취 유도 및 유지에 사용했으며 필요에 따라 추가 용량을 투여했습니다.
3. 소독 및 살균 준비
   1. 작업 플랫폼과 야외 오버헤드를 75% 에탄올 분무기로 소독합니다. 각 마우스 시술 전에 새로운 일회용 바늘 세트를 사용하는 것이 좋습니다.
      알림: 톱니 핀셋은 재사용이 가능하며 증기 멸균과 같은 선호하는 방법을 사용하여 멸균할 수 있습니다.

2. 수술 과정

1. 마우스와 하악골의 고정
   1. 접착 테이프를 사용하여 마우스를 앙와위 자세로 수술 플랫폼에 묶습니다. 두 개의 26G 바늘을 안와 귀면에 맞추고 다른 두 개의 26G 바늘을 하악 아래에 편안하게 고정합니다.
   2. 바늘 주위에 고무 밴드를 감고 앞니를 교차시켜 입을 벌리십시오. 혀를 살짝 당겨 수술 쪽 반대쪽 고무 밴드 아래에 고정하여 시야를 가리지 않도록 합니다(그림 1C).
2. 원위 저항 제거
   1. 핀셋으로 어금니를 근심 방향으로 잡고 23G 바늘을 원위치의 협측 치조골에 밀어 넣고 간격을 만듭니다.
      알림: 이 단계는 너무 깊숙이 박힌 바늘이 뿌리를 부러뜨릴 수 있으므로 매우 주의해서 수행해야 합니다.
   2. 다음으로, 25G 바늘로 변경하여 간격을 계속 확장하고 치근단 부위를 향해 섬세하게 진행하면서 바늘을 천천히 앞뒤로 그리고 설측으로(마우스 해부학적 위치로) 회전시켜 치조와에서 치근을 밀어냅니다.
3. 근심 저항 제거
   1. 충분한 공간이 있으면 23G 바늘을 사용하여 루트 포크에 삽입하고 어금니를 교합으로 들어 올립니다. 어금니를 단단히 잡은 후 23G 바늘을 더 가져다가 설근 근심 치주막에 밀어 넣어 간격을 만듭니다.
   2. 그런 다음 25G 바늘로 대체하고 천천히 앞으로 회전시킵니다. 일부 근본적인 장애가 어금니의 탈구를 방해하는 경우 26G 바늘을 사용하여 치근점을 관통하고 수술을 반복합니다.
4. 최종 추출
   1. 치아를 발치하고 발치하는 동안 크라운이 교합면 위로 높이 올라가고 두 개의 온전한 뿌리가 명확하게 보이는지 확인합니다.
      참고 : 치아의 탈구 (탈구)는 절차에서 가장 고통스럽고 고통스러운 순간으로 간주됩니다. 치아를 탈구하기 전에 발가락 핀치 테스트를 사용하여 마취 깊이를 재평가해야 하며, 따라서 필요한 경우 적당한 용량의 마취제를 투여해야 합니다.
5. 수술 후 관리
   1. 치아를 뽑은 후 마른 면봉을 발라 출혈을 멈추고 혀의 위치를 바꾸고 카프로펜(5mg/kg)을 피하 투여하고 마취에서 회복될 때까지 마우스를 항온 가열 패드에 올려 놓습니다.

3. 마우스 하악 및 추출 소켓의 이미징

1. 시료 준비
   1. 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 안과 가위를 사용하여 하악과 광대뼈에 부착된 골격 근육을 자릅니다. 하악의 아래쪽 가장자리를 따라 목구멍에서 오름차순 가지로 자른 다음 과두의 뒤쪽으로 자른 다음 하악을 아래로 당기고 하악 정중선을 따라 자릅니다. 이렇게 하면 두 개의 분리된 하악골이 수확됩니다.
   2. 표준 절차¹⁷에 따라 고정, 탈염 및 탈수를 수행하십시오. ¹⁷을 내장할 때 교합면이 카세트의 가장자리와 평행한지 확인하십시오( 재료 표 참조). 하악골을 카세트 하단에 고정하고 아래쪽 가장자리를 코킹합니다(그림 2).
      참고: 이 프로토콜은 하악 영역의 시상면을 제공합니다.
2. 마이크로톰에 시료 고정
   1. 마이크로톰의 시편 클램프를 조절하여 과두와 크라운 쪽을 5°-20° 더 돌출시켜 뿌리 펄프와 함께 제공되는 크라운 펄프의 통합 이미지를 얻습니다(그림 2).
3. 섹션 준비
   참고: 과두는 항상 절단되는 첫 번째 해부학적 구조입니다. 그것이 사라지면 어금니 영역을 여러 조각으로 자를 수 있습니다.
   1. 마이크로톰 범위를 5μm로 이동하고, 8개의 슬라이스마다 수집하고, 마지막 슬라이스에서 상아질을 찾습니다. 치근단 상아질 없이 크라운 상아질이 처음 나타나면 시편 클램프를 조정하여 치근 영역이 돌출되도록 하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
4. 섹션 수집
   알림: 절단 각도는 상아질이 크라운과 치근단 영역 모두에서 균등하게 도달할 때까지 적절합니다.
   1. 이 방향을 따라 자르고 치과 펄프가 크라운과 뿌리 모두에 나타날 때까지 현미경으로 슬라이스를 관찰하십시오. 어금니의 모호한 윤곽이 파라핀 샘플¹⁷의 표면에 나타날 때 절편을 수집한다.

이 방법의 실제 사용을 설명하기 위해 건강한 C57BL/6 마우스 2마리(생후 3개월, 둘 다 암컷)의 우측 하악 제1대구치를 추출하여 각각 1주와 4주 동안 추적 관찰했습니다. 손상되지 않은 왼쪽 하악골은 건강한 대조군으로 사용되었습니다. 그림 1A 는 26-23G 바늘과 톱니형 안과용 핀셋을 포함한 수술 기구의 특정 기능을 보여줍니다. 26G 바늘은 핀포인트 제거되고 구부러집니다. 25G 바늘은 정확한 지점에서 약 25°로 구부러져 있습니다. 23G 바늘은 수술의 핵심이며 정확한 지점에서 각각 약 25° 및 35° 구부러져 있습니다(그림 1B1, B2). 핀셋은 쥐 어금니의 모양에 맞는 1mm 길이의 이빨을 가지고 있습니다(그림 1B3). 도 1C 는 수술 전의 마우스 상태를 나타낸다. 요점은 머리 주위의 4 개의 핀의 위치와 왼쪽의 고무 밴드 아래에 혀를 고정하는 것입니다.

도 3A 는 우측 하악 제1대구치의 위치 및 형태를 나타낸다. 그림 3B 는 발치 후 응고로 즉시 채워진 치아 소켓을 나타냅니다. 1주와 2주에 마우스를 안락사시키고 하악골을 탈회하고 파라핀17에 포매하고 조각으로 분할했습니다. 그림 4A 는 1주일에 소켓의 치유 과정을 표시합니다. 스폰지와 같은 섬유주 뼈가 형성되었지만 혈전은 남아있었습니다. 2주간의 치유 과정(그림 4B)에서 소켓은 스폰지 뼈로 완전히 채워져 재생이 대략적으로 완료되었음을 의미합니다. 면역형광법(IF) 염색은 또한 조직병리학적 염색의 결과를 확증했습니다. 도 5에서, Sp7은 골수 세포, 특히 골 형성 전방인 가장자리에서 널리 발현되었다. 항상성 상태에서 섬유주 뼈는 일관되고 합류했으며 골수 세포 블록이 섬처럼 뿌려졌습니다. 그러나 수술 후 1주일이 지나자 수많은 Sp7 발현 세포가 발치 소켓을 채우고 새로 형성된 섬유주골이 주변에 뿌려졌습니다. 수술 후 4주가 지나자 상태가 역전되어 섬유주골이 다시 크게 합쳐졌고 Sp7 발현 세포의 활성은 항상성 상태에 가까운 수준으로 감소했습니다.

그림 1: 수술 기구 및 수술 준비 마우스의 물체 이미지. (A) 수술 기구는 주로 26G, 25G, 23G 바늘과 톱니 핀셋으로 구성되었습니다. (B) 바늘은 20°-40°(B1,2)의 정확한 지점에서 구부러졌습니다. 핀셋의 톱니는 크기가 약 1mm(B3)여야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 발치에서 절개까지의 절차 순서도. 이 이미지는 발치에서 절개까지의 개략적인 흐름을 보여줍니다. 프로토콜에 따라 오른쪽 하악 제1대구치를 적출한 후 마우스를 안락사시키고 하악을 적출하였다. 수확시, 하악골을 24 시간 동안 4 % POM에 담근 다음, 10 % EDTA에 다시 담갔다. 유체는 14 일 동안 매일 갱신되었습니다. 다음에, 샘플을 탈수시키고, 범용 프로토콜에 따라 파라핀에 포매시켰다. 협측 또는 설측은 시상면 슬라이스가 절편되어야 하므로 아래를 향해야 합니다. 마지막으로 샘플을 시편 클램프에 고정할 때 과두와 크라운 측면이 5°-20° 돌출되어 있어야 합니다. 약어: POM = 파라포름알데히드; EDTA = 에틸렌 디아민 테트라 아세트산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 마우스 하악 제1대구치와 발치 소켓의 입체 이미지. (A) 노란색 화살표로 표시된 오른쪽 하악 제1대구치의 입체 이미지. (B) 노란색 화살표로 표시된 수술 후 첫 번째 오른쪽 하악 어금니의 발치 소켓. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : H & E 염색. 수술 후 (A) 1주 및 (B) 4주째에 추출 소켓의 H&E 염색. 노란색 화살표는 제1대구치 추출 소켓 부근에 있는 하악 제2대구치가 치유됨을 나타낸다. 점선 직사각형 선은 치유 제1대구치 발치 소켓 영역을 나타냅니다. 스케일 바: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: IF 염색을 통한 Sp7 검출. 이 이미지는 수술 후 각각 항상성 상태(건강한 대조군) 하에서 마우스 하악골 세포와 주변 섬유주에서 Sp7 발현의 분포를 보여줍니다. 흰색 점선은 섬유주골의 추정 스케일을 윤곽을 그렸습니다. 노란색 화살표는 전형적인 Sp7 발현 세포를 나타냅니다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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