Method Article

AMEBaS: 편광 단일 셀의 비율계량 형광 타임랩스의 자동 정중선 추출 및 배경 빼기

DOI:

10.3791/64857

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Mathematics and Statistics, University of São Paulo, 2Center for Mathematics, Computing and Cognition, Federal University of ABC, 3Department of Botany, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 4Cell Biology and Molecular Genetics Department, University of Maryland, 5Department of Biosciences, University of Milan, 6Department of Physics, Politecnico di Milano

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

편광된 단일 세포의 세포 내 역학을 분석하는 현재의 방법은 종종 수동이며 표준화가 부족합니다. 이 원고는 사용자 친화적인 온라인 인터페이스에서 단일 편광 세포의 정중선 추출을 자동화하고 시간 경과로 인한 시공간 거동을 정량화하기 위한 새로운 이미지 분석 파이프라인을 소개합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 극성은 공간적으로 집중된 분자와 구조의 집합에 의해 확립된 거시적 현상으로, 세포 내 수준에서 특수 영역의 출현으로 절정에 이릅니다. 이는 세포 분열, 성장 및 이동과 같은 주요 생물학적 기능의 기초가 되는 비대칭 형태학적 구조 개발과 관련이 있습니다. 또한 세포 극성의 파괴는 암 및 위 이형성증과 같은 조직 관련 장애와 관련이 있습니다.

개별 편광 세포에서 형광 리포터의 시공간 역학을 평가하는 현재 방법은 종종 세포의 장축을 따라 정중선을 추적하는 수동 단계를 포함하며, 이는 시간이 많이 걸리고 강한 편향이 발생하기 쉽습니다. 또한 비율계량 분석은 두 개의 형광 채널을 사용하여 리포터 분자의 불균일한 분포를 보정할 수 있지만 배경 빼기 기술은 종종 임의적이며 통계적 지원이 부족합니다.

이 원고는 세포 극성 모델(꽃가루관/뿌리 모발 성장 및 세포질 이온 역학)을 사용하여 단일 세포의 시공간 거동을 자동화하고 정량화하는 새로운 계산 파이프라인을 소개합니다. 비율계량 이미지를 처리하고 세포 내 역학 및 성장의 정량적 표현을 추출하기 위해 3단계 알고리즘이 개발되었습니다. 첫 번째 단계는 배경에서 셀을 분할하여 픽셀 강도 공간에서 임계값 기술을 통해 이진 마스크를 생성합니다. 두 번째 단계는 스켈레톤화 작업을 통해 셀의 정중선을 통과하는 경로를 추적합니다. 마지막으로, 세 번째 단계는 처리된 데이터를 비율계량 타임랩스로 제공하고 비율계량 카이모그래프(즉, 시간 경과에 따른 1D 공간 프로파일)를 생성합니다. 성장하는 꽃가루 튜브에서 유전적으로 인코딩된 형광 리포터로 획득한 비율계량 이미지의 데이터를 사용하여 이 방법을 벤치마킹했습니다. 이 파이프라인은 편광된 세포의 정중선을 따라 시공간 역학을 더 빠르고 덜 편향되고 정확하게 표현할 수 있도록 하여 세포 극성을 조사하는 데 사용할 수 있는 정량적 툴킷을 발전시킵니다. AMEBaS Python 소스 코드는 다음에서 사용할 수 있습니다 https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 극성(cell polarity)은 공간적으로 집중된 분자 및 구조의 집합체의 일치된 작용이 특화된 형태학적 세포 내 도메인(subcellular domain)의 확립으로 절정에 이르는 기본적인 생물학적 과정이다1. 세포 분열, 성장 및 이동은 이러한 극성 부위에 의존하며, 그 손실은 상피 조직 관련 질환에서 암과 관련이 있습니다2.

정점으로 성장하는 세포는 극성의 극적인 예로, 끝부분의 극성 부위가 일반적으로 세포외 신호로 방향을 바꾼다3. 여기에는 신경돌기, 곰팡이 균사, 뿌리 털 및 꽃가루 튜브가 발달하는 것이 포함되며, 여러 세포 과정이 세포 끝에서 정강이를 향해 뚜렷한 차이를 보입니다. 특히 꽃가루 튜브에서는 액틴 중합, 소포 이동, 이온 농도가 현저하게 분극되어 팁에 초점을 맞춘 구배를 나타낸다4. 꽃가루 튜브는 현화 식물의 수컷 생식 식물이며 단일 세포로 알려진 가장 빠른 성장 속도 중 하나로 세포의 정점에서만 성장하여 정자 세포를 난자에 전달하는 역할을합니다. 칼슘 5 (Ca2 +) 및 양성자 6 (H +)과 같은 이....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 대화형 노트북 프로토콜

Jupyter Notebook은 아래 지침의 기반이 된 https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb 에서 Google Colab을 사용하여 웹에서 직접 사용할 수 있습니다. 또는 Jupyter Notebook을 https://github.com/badain/amebas 에서 사용할 수 있으며, 여기에서 다운로드하여 Jupyter에서 로컬로 실행하도록 구성할 수 있습니다(Anaconda는 쉬운 플랫폼 간 설치 프로세스를 제공할 수 있음). 완전한 테스트 데이터는 pH 또는 Ca2+ 리포터14를 발현하는 애기장대 꽃가루 튜브의 단일 및 이중 채널 데이터를 포함하는 Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350)에서 찾을 수 있습니다. 파이프라인은 여러 부분으로 나뉘어 있으며, 사용자별 옵션을 설정한 후 재생 버튼을 클릭하여 모든 단계를 실행할 수 있습니다. 이 연구에 필요한 파일은 AMEBaS- 기본 zip 폴더(보충 코딩 파일 1)에서 사용할 수 있습니다.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AMEBaS 파이프라인은 형광 현미경 이미지 스택에서 편광 단일 셀의 정중선 역학 추출을 자동화하여 시간 소모를 줄이고 인적 오류를 발생시킬 가능성이 적습니다. 이 방법은 성장하는 단일 세포에서 키모그래프와 비율계량 이미지 스택(그림 1)을 생성하여 이러한 시간 경과를 정량화합니다. 단일 세포 이동에 대해 작동하도록 조정할 수 있지만 추가 실험이 필요합니다. AMEBaS는 Python에서 대화형 Jupyter Notebook( 대화형 노트북 프로토콜 섹션에서 설명)으로 구현되어 프로그래밍 경험이 없어도 쉽게 사용할 수 있으며, 명령줄 도구( 배치 모드 프로토콜 섹션)로 구현되어 동일한 파라미터 세트로 여러 스택을 분석할 수 있습니다. 하나 또는 두 개의 형광 채널을 사용할 수 있지만, 프로브의 결합되지 않은 상태의 형광 방출이 세포질에서 단백질의 고르지 않은 분포로 인한 공간적 이질성을 완화할 수 있기 때문에 두 개.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 새로운 방법은 편광 세포의 형광 현미경 이미지 스택 분석을 간소화하고 자동화하는 강력한 도구입니다. ImageJ Kymograph 플러그인과 같이 문헌에 설명된 현재 방법은 관심 있는 편광 셀의 정중선을 수동으로 추적해야 하며, 이는 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 인적 오류가 발생하기 쉬운 작업입니다. 이 파이프라인에서 정중선의 정의는 골격화를 수행하는 수치적 방법(18,19)에 의해 뒷받침되기 때문에 주관적 평가가 제거되어 절차에 정량적 표준이 도입됩니다. 이는 많은 양의 데이터를 보유한 연구원에게 특히 유용하며, 모든 프레임에 대한 중간선 추출을 포함하여 다양한 요구 사항에 맞게 파이프라인을 사용자 지정할 수 있습니다. 또한 배경 값 빼기는 임의적인 경우가 많으며 지정된 채널의 모든 프레임에 대해 단일 배경 값을 수동으로 선택합니다. 여기서 isodata 분할은 각 프레임에 대한 배경 임계값을 객관적으로 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고의 저자는 경쟁적인 재정적 이익이나 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 재정 지원을 위해 FAPESP 보조금 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 보조금 GM131043 및 NSF 보조금 MCB1714993, MCB1930165 재정 지원에 감사드립니다. 모발 데이터는 인프라와 Andrea Bassi 교수와 Alex Costa 교수의 감독 하에 생성되었습니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GithubGithubhttps://github.com/badain/amebas
Google ColabGooglehttps://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
  2. Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
  3. Palanivelu, R., Preuss, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell PolarityRatiometric FluorescenceMidline ExtractionBackground SubtractionSingle Cell AnalysisFluorescence Time LapseCell SegmentationSkeletonizationKymograph GenerationPolarized Cells

Related Articles