여기에서 우리는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)의 스페로이드 형성을 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
어류 세포주는 생태 독성 평가를 위한 시험관 내 모델이 유망합니다. 그러나, 종래의 단층 배양 시스템(2D 배양)은 잘 알려진 한계(예를 들어, 배양 수명 및 일부 생체내 세포 기능의 유지)를 갖는다. 따라서, 스페로이드와 같은 3D 배양이 제안되었는데, 그 이유는 이러한 모델이 조직과 같은 구조를 재현할 수 있고, 생체 내 조건을 더 잘 재포착할 수 있기 때문이다. 이 기사에서는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)을 사용하여 스페로이드를 형성하기 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 둥근 바닥, 초저 부착, 96웰 플레이트에 세포를 도금하는 것으로 구성됩니다. 오비탈 쉐이킹(70 rpm) 하에서 5일 후, 웰 당 단일 스페로이드가 형성된다. 형성된 스페로이드는 안정적인 크기와 모양을 나타내며, 이 방법은 웰에서 여러 스페로이드가 형성되는 것을 방지합니다. 따라서 비슷한 크기의 스페로이드를 직접 고를 필요가 없습니다. 이 스페로이드 분석법의 용이성, 속도 및 재현성은 고처리량 in vitro 테스트에 유용합니다.
서론
스페로이드는 3D 배양에서 세포가 세포 간 밀접하게 접촉하여 배양될 때 형성되는 작은 세포 구체입니다. 생체 내 조직 환경을 모방하는 스페로이드의 능력은 이미 다양한 세포주와 일차 세포에서 연구되었습니다 1,2. 그러나, 스페로이드가 포유류 독성 연구를 위해 잘 개발되어 있지만, 비포유류 척추동물(예: 어류)을 이용한 독성 연구를 위한 스페로이드의 개발은 아직 진행 중이다3. 어류 세포주의 경우, 스페로이드는 다양한 유형의 웰 플레이트 (3,4,5,6,7)를 사용하는 궤도 쉐이킹 (orbital shaking, OS) 및 자성 나노 입자8를 이용한 자기 부상 방법(2)과 같은 다양한 방법으로 개발되었다. 그러나 스페로이드에 대한 이러한 배양 방법 중 일부는 다른 방법보다 더 많은 단점을 가질 수 있습....
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프로토콜
둥근 바닥 96웰 플레이트에서 ZFL 및 ZEM2S 세포주의 3D 스페로이드를 생성하는 주요 단계는 그림 1에 나와 있습니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에 사용된 용액 및 배양 배지에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
1. 세포 배양 배지 및 단층 배양
- 두 세포주(ZFL, ZEM2S)를CO2 없이 28°C의 인큐베이터에서 단층으로 성장시키고 ~80% 합류에 도달하면 1:3의 계대배양 비율로 계대배양합니다.
- 위에서 설명한 대로 배양된 ~80% 합류점에서 제브라피쉬 세포의 T75 플라스크로 시작합니다.
- 완전한 배지를 제거하고, 피펫의 도움으로 배양 플라스크에 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(0.01 M)를 첨가하여 세포를 세척한다.
- 피펫을 사용하여 3mL의 1x 트립신-0.5mM EDTA(0.05%[v/v])를 배양 플라스크에 넣고 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 28°C에서 3분 동안 배양합니다....
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결과
안정된 크기 및 형상을 갖는 웰 당 단일 스페로이드가 이 방법에 의해 형성된다. 그림 2는 궤도 진탕(70rpm) 하에서 ULA 플레이트의 웰에서 ZFL 및 ZEM2S 세포의 단일 스페로이드 형성 과정을 보여줍니다. ZFL 및 ZEM2S 세포주는 3D 배양에서 서로 다른 거동을 보입니다. ZEM2S 세포주는 궤도 진탕 첫날부터 구상 모양을 쉽게 형성할 수 있는 능력을 부여하는 특징을 나타내는 반면(그림 2E), ZFL 세포주는 원하는 구상 모양에 도달하는 데 5일이 걸립니다(그림 2A-C). 이 방법으로 생성된 스페로이드는 그림 2D(16일령 ZFL 스페로이드) 및 그림 2H(10일령 ZEM2S 스페로이드.......
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토론
이것은 제브라피쉬 간 및 배아 세포주의 스페로이드를 생성하기 위한 간단하고 쉽고 빠른 방법입니다. 이 방법은 스페로이드 형성과 관련된 과학적 연구에서 보고된 문제와 3D 스페로이드 분석의 데이터 정확도 불확실성을 극복하기 위해 기존 3D 스페로이드 방법을 수정하여 개발했습니다. 예를 들어, 보고된 문제는 취급의 어려움, 스페로이드 생성의 시간 소모적인 특성, 분석을 수행하기 위해 유사한 크기 및 모양의 스페로이드를 선택해야 하는 필요성, 행잉 드롭 방법 3,7,12에서 스페로이드를 드롭에서 마이크로플레이트로 옮기는 과정의 어려움에 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 CO2가 없는 조건에서 ZFL 및ZEM2S 세포주의 배양을 권장합니다. 두 세포주 모두에 대해 이러한 프로토콜에서 제안된 배양 배지 조성 및CO2 없는 환경은 문헌에.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구의 공동 저자 인 Márcio Lorencini 박사를 기리기 위해 화장품 분야의 우수한 연구원이자 브라질에서 화장품 연구를 촉진하는 데 전념했습니다. 저자는 장비 가용성과 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES, 브라질) (재정 코드 001) 및 Grupo Boticário의 재정 지원에 대해 생리학 부서 (UFPR)의 다중 사용자 실험실에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 투명 원형 바닥 초저 부착 마이크로플레이트, 개별 포장, 뚜껑 포함, 멸균 | Corning | 7007 | |
| DMEM, 분말, 고포도당, 피루브산 | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 영양 혼합물, 분말 | Gibco | 21700026 | |
| Hepes (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Java로 이미지 처리 및 분석( ImageJ) 1.52p 소프트웨어 | National Institutes of Health, USA | 사용 가능: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz의 L-15 Medium, 분말 | Gibco | 41300021 | |
| Orbital 쉐이커 | Warmnest | KLD-350-BI | 22mm 회전 직경 |
| Dulbeccos PBS(10x) | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin(10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - 소 태아 혈청, 유격, USDA 승인 지역 | Gibco | 12657-029 | |
| 분자생물학용 바이오시약 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), 페놀 레드 | 없음 Gibco 15400054 | ||
| ZEM2S 세포주 | ATCC | CRL-2147 | 이 세포주는 위스콘신 대학교 Michael J. Carvan 교수님께서 친절하게 기증하였습니다. 미국 밀워키) |
| ZFL 세포주 | BCRJ | 256 |
참고문헌
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
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재인쇄 및 허가
