비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.
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방법 논문
인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염
이 논문에서
요약
초록
SARS-CoV(2002년), MERS-CoV(2012년), SARS-CoV-2(2019년)의 세 가지 고병원성 인간 코로나바이러스(HCoV)가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중 보건 위기를 초래했습니다. 매년 4개의 추가 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)가 일반적인 감기 사례의 상당 부분을 유발하며, 이는 생리학적으로 관련된 시스템에서 이러한 바이러스를 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. HCoV는 호흡기로 들어가 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 부위인 비강 상피에 감염을 일으킵니다. 당사는 환자 유래 비강 샘플이 공기-액체 계면(ALI)에서 배양되는 1차 비강 상피 배양 시스템을 사용하여 이 중요한 감시 부위에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구합니다. 이러한 배양은 존재하는 세포 유형, 섬모 기능 및 점액 생성을 포함하여 생체 내 기도의 많은 특징을 요약합니다. 치사량과 계절성 HCoV를 비교한 최근 연구를 예시1로 사용하여 HCoV 감염 후 비강 ALI 배양에서 바이러스 복제, 숙주 세포 영양성, 바이러스 유도 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 특성화하는 방법을 설명합니다. 코에서 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해가 높아짐에 따라 HCoV 및 향후 등장할 가능성이 있는 기타 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 치료제의 새로운 표적을 제공할 수 있습니다.
서론
현재까지 7종의 인간 코로나바이러스(HCoV)가 확인되었으며 다양한 호흡기 질환을 유발합니다2. 일반적인 또는 계절성 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)는 일반적으로 상기도 병리와 관련이 있으며 매년 일반적인 감기 사례의 약 10%-30%를 유발합니다. 이는 일반적인 HCoV와 관련된 전형적인 임상 표현형이지만, 이러한 바이러스는 어린이, 노인 및 면역 저하자를 포함한 위험에 처한 인구 집단에서 더 심각한 하기도 질환을 유발할 수 있습니다 3,4. 중증급성호흡기증후군(SARS)-CoV, 중동호흡기증후군(MERS)-CoV, SARS-CoV-2 등 3가지 병원성 HCoV가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중보건 비상사태를 일으켰습니다. 치명적 HCoV는 더 심각한 호흡기 병리와 관련이 있으며, 이는 MERS-CoV 사례와 관련된 >34%의 치사율(2012년 출현 이후 2,500건 이상의 사례에서 894명 사망)5,6으로 명확하게 설명됩니다. 또한 현재 진행 중인 COVID-19 팬데믹에서 볼 수 있듯이 치명적인....
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프로토콜
비강 검체의 사용은 펜실베니아 대학교 기관 검토 위원회(프로토콜 # 800614) 및 필라델피아 VA 기관 검토 위원회(프로토콜 # 00781)의 승인을 받았습니다.
1. 비강 ALI 배양 감염
참고: 임상 검체의 획득과 비강 ALI 배양의 성장 및 분화는 이 논문의 범위를 벗어납니다. 일차 비강 상피 세포를 배양하기 위한 구체적인 방법은 이러한 배양물을 이용하여 최근에 발표된 연구에서 찾을 수 있다 18,22,23. 아래 프로토콜은 원하는 경우 상업적으로 이용 가능한 비강 상피 ALI 배양에 추가로 적용할 수 있습니다. 아래에 자세히 설명된 프로토콜과 용량은 24웰 플레이트 트랜스웰 인서트(직경 6.5mm, 멤브레인 표면적 0.33cm2)에 적용할 수 있습니다. 더 큰 트랜스웰(즉, 12웰 플레이트, 직경 12mm, 표면적 1.12cm2)에서 성장한 ALI 배양액을 사용하는 경우 트랜스웰 크기를 반영하도록 부피를 비례적으로 조정합니다.
- 감염....
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결과
대표적인 수치는 원고 Otter et al.1에서 찾을 수 있는 데이터에서 부분적으로 각색되었습니다. 4명 또는 6명의 기증자로부터 유래한 비강 ALI 배양은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 4가지 HCoV(SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 중 하나에 감염되었으며, 각 바이러스에 대한 평균 정점 탈락 바이러스 역가는 그림 1A에 나와 있습니다. 이 4가지 HCoV는 모두 비강 ALI 배양에서 생산적으로 복제되지만 SARS-CoV-2 및 HCoV-229E가 가장 효율적으로 복제됩니다. 이는 평균적인 바이러스 역가이며, 개별 기증자의 각 HCoV에 대한 역가가 최근에 발표되었다는 점에 유의하십시오1. 프로토콜 섹션 3에 설명된 대로 비강 ALI 배양을 세척한 후 정점 표면 액체(ASL)의 MERS-CoV 역가를 그.......
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토론
여기에 자세히 설명된 방법은 환자 유래 비강 상피 세포가 공기-액체 계면에서 성장하고 HCoV-숙주 상호 작용 연구에 적용되는 1차 상피 배양 시스템을 설명합니다. 일단 분화되면, 이러한 비강 ALI 배양은 섬모, 잔 및 기저 세포가 대표되는 이질적인 세포 집단뿐만 아니라 섬모와 점액 분비가 강력하게 박동하는 온전한 점액 섬모 기능을 포함하여 생체 내 비강 상피의 많은 특징을 요약합니다. 이러한 이질적인 세포 집단은 바이러스 감염 중 숙주 세포 영양성의 특성을 분석할 수 있기 때문에 기존 호흡기 상피 세포주에 비해 이 배양 시스템의 주요 이점입니다( 그림 2 참조). 또한 전통적인 기도 상피 세포주에는 인터페론 생성과 같은 선천성 면역 경로와 함께 호흡기 바이러스에 대한 1차 방어에 중요한 역할을 하는 기능적 점액섬모 제거 메커니즘이 없습니다.
프로토콜 내의 중요한 단계에는 초기 감염 절차가 포함됩니다. 예를 .......
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공개 사항
수잔 와이스(Susan Weiss)는 오큐젠(Ocugen)의 과학 자문 위원회에 소속되어 있습니다. 노암 A. 코헨(Noam A. Cohen)은 GSK, 아스트라제네카(AstraZeneca), 노바티스(Novartis), 사노피/레제론(Sanofi/Regeron), 오이스터 포인트 파마슈티컬스(Oyster Point Pharmaceuticals)의 자문을 맡고 있으며, 미국 특허인 "호흡기 감염 치료 및 진단"(10,881,698 B2, WO20913112865)을 보유하고 있으며, GeneOne Life Sciences와 라이선스 계약을 체결했습니다.
감사의 글
이 연구의 자금 출처는 다음과 같습니다: 미국 국립보건원(NIH) R01AI 169537(S.R.W. 및 N.A.C.), NIH R01AI 140442(S.R.W.), VA Merit Review CX001717(N.A.C.), VA Merit Review BX005432(S.R.W. 및 N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation(S.R.W. 및 N.A.C.), T32 AI055400(CJO), T32 AI007324(AF).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 2차 항체 (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + 칼슘 + 마그네슘 | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G 측정 챔버 | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| 상피 세포 접착 마커(EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | 버전 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI 리소스 | NR-470 | |
| HCoV-NL63 뉴클레오캡시드 항체 | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli 샘플 버퍼 (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 세포 | ATCC | CCL-7 | HCoV-NL63 |
| MERS-CoV(인간 코로나바이러스, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), EMC/2012) | BEI 리소스 | NR-44260 | |
| MERS-CoV 뉴클레오캡시드 항체 | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC 항체 | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview 컨포칼 현미경 | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| 플레이트 리더 | Perkin Elmer | HH34000000 | 모든 플레이트 리더 또는 ELISA 리더로 충분합니다. 492nm |
| RIPA 버퍼(50mM Tris pH 8, 150mM NaCl, 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2(SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI 리소스 | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 항체 | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β-tubulin 항체 | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 세포 | ATCC | CCL-81 | MERS-CoV |
| VeroE6 세포 | ATCC | CRL-1586 | SARS-CoV-2 적정 |
참고문헌
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120(2023).
- Fehr, A., Perlman, S.
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