방법 논문

생존 가능한 단일 세포를 분리하기 위한 췌장 조직 해부

DOI:

10.3791/64871

⸱

2023년 5월 26일

 ,  , 
1The Lautenberg Center for Immunology and Cancer Research, The Institute for Medical Research Israel-Canada, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem

이 논문에서

요약

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췌장 메타 플라스틱 세포는 췌장 종양을 일으키는 악성 세포의 전구체입니다. 그러나 온전한 생존 가능한 췌장 세포를 분리하는 것은 어렵습니다. 여기에서는 췌장 조직 해리를 위한 효율적인 방법을 제시합니다. 그런 다음 세포를 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 또는 2차원 또는 3차원 공동 배양에 사용할 수 있습니다.

초록

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췌장에는 호르몬을 생산하고 분비하는 내분비계와 췌장의 약 90%를 차지하고 소화 효소를 생산하고 분비하는 세포를 포함하는 외분비계의 두 가지 주요 시스템이 있습니다. 소화 효소는 췌장 아시나 세포에서 생성되어 자이모겐(zymogen)이라고 하는 소포에 저장되었다가 췌관을 통해 십이지장으로 방출되어 대사 과정을 시작합니다. 아시나 세포에서 생성된 효소는 세포를 죽이거나 cell-free RNA를 분해할 수 있습니다. 또한 아시나 세포는 깨지기 쉬우며, 일반적인 해리 프로토콜은 많은 수의 죽은 세포와 cell-free 프로테아제 및 RNase를 초래합니다. 따라서 췌장 조직 소화의 가장 큰 과제 중 하나는 온전하고 생존 가능한 세포, 특히 아시나 세포를 회복하는 것입니다. 이 문서에 제시된 프로토콜은 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 개발한 2단계 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 정상 췌장, 전악성 병변을 포함하는 췌장 또는 많은 수의 기질 및 면역 세포를 포함하는 췌장 종양을 소화하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

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췌관 선암(PDAC)은 가장 공격적인 암 유형중 하나입니다 1. 임상적 증거는 PDAC가 KRAS 원발암유전자2의 돌연변이에 의해 수년에 걸쳐 아시나 세포를 포함한 외분비 시스템 세포에서 발생한다는 개념을 뒷받침합니다.

췌장 종양에는 다양한 세포 유형이 포함되며, 악성 세포는 종양 질량의 20%-50%에 불과하다는 것이 입증되었습니다3. 다양한 세포 유형이 상피 세포와 상호 작용하여 형질전환을 지원하며 종양 형성 및 성장을 촉진합니다. 초기 사건은 췌장 상피내 종양(PanIN)이라고 하는 미세한 병변을 유발하는 침상 상피화생을 유발하며, 경우에 따라 PDAC4로 발전할 수 있습니다.

이러한 상호 작용을 조사하고 중추적인 신호를 목표로 삼아야 합니다. 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 단일 세포 분해능으로 유전자 발현을 밝혀 상피 세포가 겪는 변화를 추적하여 췌장암 발병을 탐색할 수 있는 강력한 방법입니다.

단일 세포에 대한 조직 절개 및 분해는 scRNA....

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프로토콜

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히브리 대학교(이스라엘 예루살렘)와 하다사 메디컬 센터(이스라엘 예루살렘)의 공동 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)는 동물 복지를 위한 연구 프로토콜(MD-18-15417-5 "생쥐의 췌장암 조직 역학")을 승인했으며, 여기에 제시된 프로토콜은 동물 실험 및 연구에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수했습니다. 히브리 대학교는 국제 공인 기관인 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회입니다.

참고: 마우스 균주 스톡 #007908, 스톡 #019378 및 스톡 #008179는 Jackson의 실험실에서 수득하였다. PRT(크라스+/LSL-G12D; PTF1a-CREER입니다. Rosa26LSL-tdTomato) 마우스는 상기 균주를 교배하여 생성하였다. 생후 6주에서 15개월 사이의 남녀 생쥐가 연구에 사용되었다. 타목시펜은 분말을 옥수수 기름에 용해시켜 제조하였다. 성인 마우스 (6-8 주 나이, 여성 및 남성)는 400 mg/kg의 복용량으로 0 일과 2 일에 타목시펜을 피하 주사하고 주사 후 일주일에 두 번 검사했습니다. 종양이 내부에 위치했기 때문에 종양을 측정하는 것은 불가능했습니다. 따라서 윤리 프로토콜에 따라....

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결과

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최근 발표된 연구5에서는 위에서 설명한 프로토콜을 적용하여 마우스 모델을 사용하여 PDAC 개발의 초기 단계를 탐색했습니다. 마우스는 타목시펜 주입 후 아시나 세포에서 구성적으로 활성화된 KRAS의 발현을 허용하는 카세트 Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7을 포함하도록 유전자 조작되었습니다.

자궁경부 탈구 후(마우스 윤리 프로토콜에 따라) 췌장을 절제하고, 위에서 설명한 프로토콜을 적용하였다( 그림 1 및 프로토콜 참조).

해리 프로토콜을 최적화하기 위해, 트립신 C로 조직의 사전 배양을 하거나 하지 않고 해리를 수행했습니다. 트립신 C를 사용한 사전 배양은 생존력에 영향.......

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토론

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이 글에서는 췌장 조직 해리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 간단하고 사용하기 쉬우며 고형 종양을 포함한 악성 종양 과정의 여러 단계에서 췌장 조직에서 생존 가능한 단일 세포를 분리하는 도구를 제공합니다. 이전 연구에서는 췌장을 소화하기 위해 다양한 유형의 콜라겐 분해 효소가 사용되었습니다 8,9. 콜라겐분해효소 D와 같은 매우 강력한 콜라겐분해효소를 사용하면 면역 세포가 많아지고 상피 세포의 비율이 낮아집니다. 콜라겐분해효소 P를 사용하면 췌장이 온전하거나 종양이 있는 췌장 조직에 적합한 소화가 가능합니다.

관찰 결과, 모든 세포 유형을 분리할 수 있습니다. 우리는 이전에 면역조직화학(immunohistochemistry)을 사용하여 면역 T 세포의 침윤을 검증했습니다5; 우리는 분석에서 관찰한 상대적인 세포 수가 연약하.......

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공개 사항

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저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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데이터 분석에 도움을 주신 Avital Sarusi-Portuguez 박사와 이전 연구에서 프로토콜을 확립하는 데 도움을 주신 Dr. Dr. Kolodkin-Gal에게 감사드립니다. 파르나스 연구소의 모든 과거와 현재 구성원에게 감사드립니다. 편집에 도움을 주신 Gillian Kay 박사님과 Michael Kanovsky 박사님께 감사드립니다. 이 프로젝트는 이스라엘 과학 재단 보조금(No. 526/18 O.P.), Alex U. Soyka 프로그램 및 이스라엘 암 연구 기금(Research Career Development Award)의 보조금을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 또는 자원
70 µ M 나일론 메쉬 코닝cat##431751
BSASigma Aldrichcat# A7906
Collagenase PRochecat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPISigma Aldrichcat#MBD0015
Dnase IRochecat# 10104159001
실험 모델: 유기체/ 스트레인
태아 소 세럼 남미ThermoFisherCat#10270106
Hanks' Balanced Salt SolutionBiological industriescat#02-018-1A 
KRASLSL-G12D 생쥐Jackson LaboratoryJAX008179
MACS 데드 셀 제거 키트Milteny Bioteccat#130-090-101
PBSBiological industriescat#02-023-1A 
Ptf1a-CreER mice잭슨 연구소JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-td토마토 마우스잭슨 연구소JAX007908
트립신 C-EDTA 0.05%생물학 산업cat# 03-053-1A
트립신 억제제Rochecat#T6522

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117....

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재인쇄 및 허가

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