소 단핵구 유래 수지상 세포를 이용한 백신 면역원성 측정

요약

이 방법론은 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 생성과 소의 잠재적인 동물용 백신 개발 중 항원 후보의 시험관 내 평가를 위한 적용을 설명합니다.

초록

수지상 세포(DC)는 면역 체계 내에서 가장 강력한 항원 제시 세포(APC)입니다. 그들은 병원체를 찾기 위해 유기체를 순찰하고 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 연결하여 면역 체계 내에서 독특한 역할을 합니다. 이 세포는 식세포화한 다음 포획된 항원을 이펙터 면역 세포에 제시하여 다양한 범위의 면역 반응을 유발할 수 있습니다. 이 논문은 소 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 소 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)의 시험관 내 생성을 위한 표준화된 방법과 백신 면역원성 평가에 대한 적용을 보여줍니다.

자기 기반 세포 분류를 사용하여 PBMC에서 CD14+ 단핵구를 분리하고, 완전한 배양 배지에 인터루킨(IL)-4를 보충하고 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 사용하여 CD14⁺ 단핵구가 나이브 MoDC로 분화되도록 유도했습니다. 미성숙 MoDC의 생성은 주요 조직적합성 복합체 II(MHC II), CD86 및 CD40 세포 표면 마커의 발현을 검출하여 확인되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 광견병 백신을 사용하여 미성숙 MoDC를 펄싱했으며, 이후 나이브 림프구와 공동 배양되었습니다.

항원 펄스 MoDC와 림프구 공동 배양의 유세포 분석은 Ki-67, CD25, CD4 및 CD8 마커의 발현을 통한 T 림프구 증식의 자극을 밝혀냈습니다. 정량적 PCR을 사용하여 IFN-γ 및 Ki-67의 mRNA 발현을 분석한 결과, MoDC가 이 시험관 내 공동 배양 시스템에서 림프구의 항원 특이적 프라이밍을 유도할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, ELISA를 사용하여 평가된 IFN-γ 분비는 비항원 펄스 MoDC-림프구 공동 배양보다 광견병 백신 펄스 MoDC-림프구 공동 배양에서 유의하게 더 높은 역가(**p < 0.01)를 보였다. 이러한 결과는 백신 면역원성을 측정하기 위한 이 시험관 내 MoDC 분석의 타당성을 보여주며, 이는 이 분석이 생체 내 시험을 진행하기 전에 소에 대한 잠재적인 백신 후보를 식별하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 상용 백신의 백신 면역원성 평가에서도 사용될 수 있음을 의미합니다.

서론

수의학 예방 접종은 전 세계적으로 가축 부문에 영향을 미치는 질병에 대한 보호를 제공함으로써 식량 안보와 동물 복지 개선에 기여하기 때문에 축산 및 건강의 중요한 측면을 나타냅니다¹. 가능한 백신 후보의 면역원성을 평가하는 효과적인 시험관 내 방법은 백신 개발 및 생산 과정을 가속화하는 데 도움이 될 것입니다. 따라서 시험관 내 연구를 기반으로 한 혁신적인 방법론으로 면역 분석 분야를 확장하는 것이 필요하며, 이는 예방 접종 및 병원체 감염과 관련된 면역 과정의 복잡성을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 현재, 주기적인 샘플링(예: 혈액 및 비장)이 필요한 생체 내 동물 면역화 및 챌린지 연구는 후보 백신 및 보조제의 면역원성을 측정하는 데 사용됩니다. 이러한 분석은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 윤리적 의미가 있는데, 대부분의 경우 동물 안락사는 시험이 끝날 때까지 수행되기 때문입니다.

생체 내 분석의 대안으로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 시험관 내^백신 유도 면역 반응을 평가했습니다 2. PBMC는 70%-90% 림프구, 10%-20% 단핵구 및 제한된 수의....

프로토콜

채혈은 오스트리아 보건식품안전청(AGES)의 윤리 가이드라인과 동물복지 기준³²에 따라 공인된 수의사에 의해 수행됩니다. 이 연구는 오스트리아 농무부로부터 윤리적 승인을 받았습니다. MoDC 생성 및 후속 적용을 위한 실험 설계는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 순진한 MoDC의 생산

참고: 전혈 샘플은 헤파린화된 진공제를 사용한 경정맥 천자에 의해 병원체가 없는 단일 송아지에서 얻었습니다(이 연구에는 8개의 9mL 혈액 튜브가 사용됨). 아이스 박스에 혈액을 운반하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 2-4 °C에서 보관하거나 즉시 처리하십시오. 혈액 응고를 피하기 위해 혈액을 계속 회전시키십시오. 진공 청소기를 70 % 에탄올로 소독하십시오. 다음의 모든 실험은 하나의 생물학적 샘플과 6개의 기술 복제물로 수행되었습니다.

1. 헤파린화된 혈액에서 PBMC를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리
   1. 혈액을 10 배 뒤집어 잘 섞는다.
   2. 10mL 피펫을 사용하여 헤파린화된 혈액 20mL를 멸균된 50mL 튜브로 옮기고 10mL의 ....

결과

이 방법론은 생체 내 연구를 수행하기 전에 후보 백신 항원을 평가하기 위한 소 MoDC의 시험관 내 생성을 설명합니다. 그림 1은 소 MoDC 생성의 실험 계획과 시험관 내 분석을 위한 MoDC의 적용을 보여줍니다. 자기 기반 세포 분류 기술을 사용하여 이전에 50mL의 소 혈액에서 분리된 수확된 PBMC에서 약 2,600만 개의 CD14⁺ 근세포를 수집할 수 있었습니다. CD14+ 단핵구가 없는 용출된 세포 분획은 림프구가 풍부했으며 나이브 CD4+ 및 CD8⁺ T 세포(CD14^- 림프구 세포 분획)의 공급원으로 사용되었습니다.

나이브 단핵구 분획은 CD14 세포 염색 및 유세포 분석 후 관찰된 바와 같이 98% CD14⁺ 단핵구 세포로 구성되었습니다(

토론

이 연구는 소 MoDC를 생성 및 표현형화하기 위한 표준화된 시험관 내 방법과 상업용 백신(예: RV)의 백신 면역원성을 측정하는 데 사용하는 방법을 보여줍니다. 소 MoDC는 가축 질병에 대한 잠재적인 백신 항원을 스크리닝하고 생체 내 동물 시험을 진행하기 전에 면역 반응을 기반으로 잠재적인 임상 영향을 예측하기 위한 도구로 사용할 수 있습니다. 생성된 MoDC는 형태학적, 표현형적, 기능적 특성에 따라 식별되었습니다. 우리는 소 CD14⁺ 단핵구에서 유래한 MoDC가 확장된 수상돌기, MHC II와 같은 항원 제시를 위한 세포 표면 마커의 발현, CD40 및 CD86과 같은 MoDC에서 공동 자극 분자의 발현, 내세포 활성 및 나이브 림프구를 활성화하는 능력.

본 실험에 사용된 세포 배양 배지(DMEM 및 RPMI)는 세포 분화 및 배양에 널리 사용되며, RPMI는 단핵구 분화에 더 자주 채택된다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	수확된 PBMC 분획
BD Vacutainer Heparin Tubes	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL, 첨가제 sodium heparin 158 USP units, glass tube, 16 x 100 mm size
bovine dendritic cell growth kit	Bio-Rad, 영국	PBP015KZZ	재조합 소 IL-4 및 GM-CSF
소 IFN-감마로 구성된 사이토카인 칵테일; ELISA Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	IFN-&gamma 측정에 사용되는 키트, 배양 상등액
CD14 항체	Bio-Rad	MCA2678F	Mouse anti-bovine CD14 monoclonal 항체, 클론 CC-G33, isotype IgG1
CD25 항체	Bio-Rad	MCA2430PE	Mouse anti bovine CD25 monoclonal antibody, 클론 IL-A11, isotype IgG1
CD4 항체	Bio-Rad	MCA1653A647	마우스 항 소 CD4 단클론 항체, 클론 CC8, isotype IgG2a
CD40 항체	Bio-Rad	MCA2431F	마우스 anti-bovine CD40 단클론 항체, 클론 IL-A156, isotype IgG1
CD8 항체	Bio-Rad	MCA837F	마우스 anti bovine CD8 monoclonal 항체, 클론 CC63, isotype IgG2a
CD86 항체	Bio-Rad	MCA2437PE	마우스 항소 CD86 단클론 항체, 클론 IL-A190, 이소타입 IgG1
CFX96 터치 실시간 PCR 감지 시스템	Bio-Rad-Thermal		cycler PCR 기계
코닝 원심분리기 튜브	팔콘 코닝	352096 & 352070	15 mL 및 50 mL, 고선명 포이프로필렌 원뿔형 바닥, 졸업, 스테리얼, 밀봉 나사 캡, 팔콘 튜브
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	BD golgiPlug가 포함된 고정/투과화 키트, 플로우 사이토미터 세포 염색에 사용
에탄올	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute를 분석에 사용 EMSURE  ACS, ISO, 리그. Ph Eur
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualified, heat inactivated
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	림프구 분리 매체
FlowClean Cleaning Agent	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-		플로우 사이토미터 히스토그램 소프트웨어
FlowTubes/ FACS  (Fluorescence-activated single-cell sorting) 튜브	팔콘 코닝	352235	5 mL, 스테리얼, 세포 여과기 스냅 캡이있는 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 유세포 분석
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios 유세포 분석기	Beckman Coulter-Flow		Cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR plates	Bio-Rad	HSP9601	96 well, low profile, thin wall, skirted, 백색/투명
인간 CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter,	Germany-Flow	cytometer multicolor data analysis software
MACS Column	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	세포 표면 항원을 기반으로 다양한 CD14 세포 집단을 분리하기 위한 자기 활성화 세포 분류 또는 면역 마젠틱 세포 분리 컬럼
MHC Class II DQ DR 다형성 항체	Bio-Rad	MCA2228F	마우스 안티 양 MHC Class II DQ DR 다형성:FITC, 클론 49.1, 동형 IgG2a, 소
마이크로 원심분리기 튜브	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL, 원뿔형 바닥, 졸업, 입체 튜브
Microsoft Power Point	Microsoft	-	실험 디자인의 그래픽 일러스트레이션
마우스 IgG1 음성 대조군:CD14, CD40 항체	Bio-Rad	MCA928F	Isotype 대조군 CD14 및 CD40 단클론 항체용 FITC
마우스 IgG1 음성 대조군:CD86 항체용 PE	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype 대조군 CD86 단클론 항체
마우스 IgG1 음성 대조군:CD25 항체용 RPE	Bio-Rad	MCA928PE	Isotype 대조군 CD25 단클론 항체
마우스 IgG2a 음성 대조군: MHC 클래스 II 항체에 대한 FITC	Bio-Rad MCA929F		MHC 클래스 II 단클론 항체에 대한 Isotype 제어
Nobivac 광견병	MSD Animal Health, UK-1		µ > 2 I.U./mL 광견병 바이러스 균주를 함유한 세포 배양 불활성화 백신의 L/mL
광학 밀봉	Bi0-Rad	TCS0803	0.2mL 평면 PCR 튜브 8캡 스트립, 광학, 초투명, qPCR 기계와 호환
페니실린-스트렙토마이신	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100mL
인산염 완충액 식염수(PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4, 1x 농도
Prism - GraphPad 5 소프트웨어	Dotmatics-Statistical		Software
Purified Anti-human Ki-67 항체	Biolegend, USA	350501	Monoclonal 항체, 암소와 교차 반응, 클론 ki-67
정제 마우스 IgG1 k Isotype Ctrl 항체	Biolegend	400101	Ki-67 monoclonal 항체
READIDROP Propidium Iodide	BD BioSciences	1351101	유세포 분석에 사용되는 살아있는/죽은 세포 마커, 아민 반응성 염료
재조합 인간 IL-2 단백질	R& D System, 미국	202-IL-010/CF	인터루킨-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	총 RNA 추출에 키트 사용; RLT 버퍼 = 용해 버퍼; RW1 완충액 = 엄격한 구아니딘 함유 세척 완충액; RDD 버퍼 = DNase 버퍼; RPE 완충액 = 마일드 세척 완충액; RNaseOUT = RNase 억제제.
RPMI 1640 중간	시그마 Aldrich	R8758	세포 배양 배지, L-글루타민 및 중탄산나트륨
SMART-servier 의료 예술	Les Laboratories Servier	-	크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, ROX normalization dyes.
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit for cDNA synthsis
조직 배양 테스트 플레이트 24	TPP, 스위스	92024	24 웰 플레이트, 방사선 멸균, 성장 강화 처리, 용량 3.18 mL
Trypan Blue Solution	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%, 100 mL, 세포 생존율
평가를 위한 염료UltraPure DNase/RNase-Free 증류수	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0.1 µ m 멤브레인 여과 증류수
VACUETTE 헤파린 혈액 수집 튜브	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin Blood Collection Tubes는 녹색 상단을 가지고 있으며 내벽에 분무 건조 된 리튬, 나트륨 또는 암모늄 헤파린을 함유하고 있으며 임상 화학, 면역학 및 혈청학에 사용됩니다. 항응고제인 헤파린은 항트롬빈을 활성화하여 응고 폭포를 차단하여 전혈/혈장 샘플을 생성합니다.
Water	Sigma Aldrich	W3500-1L	세포 배양에 적합한 멸균 여과, bioReagent