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방법 논문

혈관 및 종양 이미징을 위한 밝은 NIR-II 형광 프로브

2.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64875

⸱

2023년 3월 17일

 ,  , 
1College of Science, Research Center for Ecology, Laboratory of Extreme Environmental Biological Resources and Adaptive Evolution, Tibet University, 2State Key Laboratory of Virology, Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (MOE) and Hubei Province Engineering and Technology Research Center for Fluorinated Pharmaceuticals, Wuhan University School of Pharmaceutical Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 NIR-II 광학 이미징 장치를 사용한 마우스의 상세한 실시간 NIR-II 형광 이미징 동작을 설명합니다.

초록

새로운 이미징 기술인 근적외선 II(NIR-II, 1000-1700nm) 형광 이미징은 높은 감도, 심층 조직 침투, 공간 및 시간 해상도를 통한 우수한 이미징으로 인해 생물 의학 분야에서 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 의학 및 약학과 같이 시급히 필요한 일부 분야에서 NIR-II 형광 이미징의 구현을 용이하게 하는 방법은 관련 연구자들을 당황하게 했습니다. 이 프로토콜은 DAD(기증자-수용체-기증자) 골격이 있는 NIR-II 형광 분자 프로브 HLY1의 구성 및 바이오이미징 응용 분야에 대해 자세히 설명합니다. HLY1은 우수한 광학적 특성과 생체적합성을 보였다. 또한, NIR-II 광학 이미징 장치를 사용하여 마우스의 NIR-II 혈관 및 종양 이미징을 수행했습니다. 실시간 고해상도 NIR-II 형광 이미지를 획득하여 종양 및 혈관 질환의 검출을 안내했습니다. 프로브 준비에서 데이터 수집에 이르기까지 이미징 품질이 크게 향상되고 생체 내 이미징에서 데이터 기록을 위한 NIR-II 분자 프로브의 신뢰성이 보장됩니다.

서론

형광 이미징은 기초 연구에서 일반적으로 사용되는 분자 이미징 도구이며, 클리닉에서 외과적 종양 절제술을 안내하는 데에도 자주 사용됩니다1. 형광 이미징의 필수 원리는 샘플(조직, 장기 등)을 조사한 후 레이저에서 방출되는 형광을 수신하기 위해 카메라를 사용하는 것입니다. 2. 프로세스는 몇 밀리 초 이내에 완료됩니다3. 형광 이미징 파장은 자외선 (200-400 nm), 가시 영역 (400-700 nm), 근적외선 I (NIR-I, 700-900 nm) 및 근적외선 II (NIR-II, 1000-1700 nm) 4,5,6. 생물학적 조직의 헤모글로빈, 멜라닌, 데 옥시 헤모글로빈 및 빌리루빈과 같은 내인성 분자는 가시 광선 영역의 빛에 강한 흡수 및 산란 효과를 가지므로 빛의 침투 및 감도가 크게 감소하고 가시 광선 파장의 형광 이미징에 악영향을 미칩니다 7,8,9.

NIR-II 형광 이미징은 낮은 광자 흡수 및 산란, 높은 이미징 속도 및 높은 이미지 대비(또는 감도)를 가지고 있습니다10,11. 형광 파장이 증가함에 따라 생물학적 조직에서 형광의 흡수 및 산란은 점차 감소하고 NIR-II 영역의 자동 형광은 매우 낮다12. 따라서, NIR-II 창은 조직의 침투 깊이를 상당히 증가시키고, 더 높은 해상도 및 신호 대 잡음비13,14,15를 얻는다. NIR-II 창은 NIR-IIa(1300-1400nm) 및 NIR-lIb(1500-1700nm) 창으로 더 세분화할 수 있습니다(16). 현재까지 무기 재료 단일벽 탄소 나노튜브, 희토류 나노입자, 양자점 및 유기 재료 반도체 고분자 나노입자, 소분자 염료, 응집 유도 발광 재료 등을 포함하여 여러 획기적인 NIR-II 재료가 보고되었습니다. 1,17,18,19,20,21,22. 무기 나노물질은 간, 비장 등에 쉽게 축적되며 잠재적인 장기 생체 독성을 가지고 있다23. 유기 소분자 형광단은 빠른 신진대사, 낮은 독성, 쉬운 변형 및 명확한 구조의 장점을 가지고 있어 임상용으로 가장 유망한 프로브입니다24.

NIR-II 광학 이미징 시스템은 NIR-II 프로브에서 NIR-II 형광 신호를 효과적으로 수집하여 정확한 기능, 해부학적 및 분자 이미지를 렌더링할 수 있기 때문에 형광 바이오이미징의 중요한 구성 요소이기도 합니다(25,26). NIR-II 이미징 시스템은 주로 단파 적외선 카메라, 장거리 통과(LP) 필터, 레이저 및 컴퓨터 프로세서로 구성됩니다. 생체 내 NIR-II 형광 영상은 질병의 메커니즘과 생명의 본질을 설명하기 위한 가장 실현 가능한 영상 접근법 중 하나로 간주됩니다27,28,29. NIR-II 이미징 기술은 암세포 검출, 동적 이미징, 생체 내 표적 추적 및 표적 치료와 같은 생물 의학 분야, 특히 종양학 연구에서 널리 사용되었습니다30,31. 그러나 이미징 프로브 및 기기에 대한 NIR-II 이미징 기술의 높은 기술적 요구 사항을 고려할 때 다양한 분야의 연구원의 실제 사용을 방해하고 제한합니다. 따라서 NIR-II 이미징 프로브의 준비와 NIR-II 이미징의 응용은 이 기사에서 자세히 소개됩니다.

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프로토콜

NIR-II 이미징 연구를 위한 동물 실험은 국제 실험 동물 관리 협회(AALAC)를 수상한 우한 대학의 동물 실험 센터에서 수행되었습니다. 모든 동물 연구는 중국 동물 복지 위원회의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 우한 대학교 동물 실험 센터의 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

6주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스(~20g)를 본 연구에 사용했습니다.

1. NIR-II 이미징 준비

  1. 시중에서 판매되는 검은색 판지( 재료 표 참조)를 캐리어 중앙에 놓습니다. 그런 다음 샘플을 검은색 판지 위에 올려 샘플이 캐리어의 중앙(이미징 장치에 있는 스테이지)에 오도록 합니다.
    참고: 흰색 판지와 비교하여 검은색 판지는 NIR-II 이미징 중에 배경 간섭이 적습니다.
  2. NIR-II 프로브의 파장에 따라 적합한 필터를 선택하십시오. 시스템이 필터를 광학 이미징 경로로 이동할 때 화면 인터페이스에서 필터 모델에 해당하는 상자 영역(예: 900LP)을 제어하려면 길게(>2초) 누릅니다.
  3. 캐리어 콘솔이 위로 올라갈 수 있도록 캐리어 콘솔 제어 영역의 터치 스크린 인터페이스에서 플랫폼을 길게 누릅니다. 캐리어 콘솔이 아래로 내려가도록 플랫폼을 길게 누릅니다.
  4. 플랫폼 높이를 "0mm"(높이 조정)로 조정하고 자동 초점을 사용하여 NIR-II 이미지를 선명하게 만듭니다.

2. NIR-II 염료(HLY1)의 합성

  1. 합성 실험에 필요한 원료의 무게를 잰다. 열화되지 않는지 확인하십시오.
  2. 화합물 1 (200 mg, 0.18 mmol), PdCl 2(dppf)2CH2Cl2 (28mg, 0.04 mmol), N-페닐-N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)나프탈렌-2-아민 (170 mg, 0.4 mmol), 및K2CO3(46 mg, 0.34 mmol)을 25 mL 둥근 바닥 플라스크의 테트라히드로푸란 (THF) 용액에 넣는다. 혼합물을N2 분위기 하에 75°C에서 4시간 동안 교반한다(도 1A).
    참고: 화합물 1 및 N-페닐-N-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)나프탈렌-2-아민의 합성 절차에 대해서는 Li etal 21을 참조하십시오. 화학 구조는 그림 1A에 나와 있습니다.
  3. 상온으로 냉각한 후 증류수(80mL)로 반응을 종결하고 DCM(디클로로메탄)/H2O(30mL)(3회)로 혼합물을 추출합니다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피 16(석유 에테르:DCM =10 :1)으로 정제하여 HLY1을 녹색 고체(78mg, 30% 수율)로 만듭니다.
  4. 나중에 사용할 수 있도록 염료 HLY1을 냉장고의 질소 보호 아래에 두십시오. 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

3. 물 필수 나노프로브의 제조

  1. HLY1(1mg) 및 양친매성 캡슐화 물질, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2k(DSPE-PEG2k, 10mg; 재료 표 참조)를 칭량합니다.
  2. 캡슐화 매트릭스(나노침전법12)로 DSPE-PEG2k를 사용하여 HLY1 도트20을 준비합니다(그림 1C). HLY1을 THF(1mL)에 녹이고 25°C에서 초음파 처리하면서 DSPE-PEG2k 수용액(9mL)이 들어 있는 비커에 천천히 추가합니다. 이어서, 투석20에 의해 혼합물로부터 THF를 제거한다.
  3. 상기 용액을 한외여과 18(7100 x g에서10분)로 원심분리하여 농축한 다음, 나중에 사용할 수 있도록 4°C 냉장고에 보관한다. 최대 1 개월 동안 보관할 수 있습니다.
    참고: DSPE-PEG2k 에 의해 로드된 나노프로브 수용액은 0°C 이상에서 보관하고 가능한 한 빨리 사용해야 합니다.

4. 종양 보유 마우스의 구성

  1. 4T1 마우스 유방암 세포(4T1)를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS) 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(표 참조)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM )에서 배양하고, 37°C에서 5%CO2 로 가습된 인큐베이터에서 유지합니다.
  2. NIR-II 형광 이미징 실험을 위해, 4T1 세포(5 x 107)를 24시간 동안 배양하고, 트립신(1mL)으로 분해하고, 무혈청 DMEM(4mL)으로 2회 세척합니다.
  3. isoflurane (2 %)으로 치료하여 마우스를 마취시킵니다. 생쥐의 발가락이나 발바닥을 자극하여 적절한 마취를 확인하고 생쥐가 반응하는지 관찰합니다. 반응이 없으면 마취가 충분하다는 뜻이다32.
  4. 그 후, 인슐린 주사 바늘을 이용하여, 피하 주사(100 μL)를 통해 마우스에 4T1 세포 혼합물을 주입한다.
    참고: NIR-II 이미징 연구는 종양이 ~100mm3의 부피로 성장한 접종 후 ~2주 후에 수행되었습니다. NIR-II 종양 영상 촬영 전에 종양 크기를 확인하십시오. 종양 크기는 본 연구11을 위해 전자 버니어 캘리퍼스에 의해 추정되었다.

5. 생체 내 NIR-II 형광 이미징

  1. 마우스를 이소플루란(2%)으로 처리하여 마우스를 마취시키고, 광학 NIR-II 이미징 시스템을 사용하여 마우스의 전신에 대한 NIR-II 이미징을 수행한다( 재료 표 참조).
    참고: 생쥐의 죽음을 피하기 위해 마취제 복용량에 주의하십시오. 일반적으로 마취는 5-10 분 동안 지속됩니다. 생쥐의 발가락이나 발바닥을 자극하고 생쥐가 반응하는지 관찰하십시오. 반응이 없으면 마취가 충분하다는 의미입니다.
  2. HLY1 도트 용액(0.8mg/mL, 200μL)을 취합니다. 마취된 마우스에 HLY1 도트를 정맥주사하고, 3분 후, NIR-II 이미징 시스템을 이용하여 마우스의 전신 혈관에 대한 NIR-II 형광 이미징을 수행하였다. 뇌 혈관 영상을 수집하기 위해 마우스의 머리에 더 초점을 맞춥니다.
    참고: 이미징 중에 깨끗한 실험용 장갑을 사용하면 깨끗한 NIR-II 이미지를 얻는 데 도움이 됩니다.
  3. 마우스에 HLY1 도트를 주입한 후 5분 후에 이미지를 수집하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리했습니다. 광학 NIR-II 이미징 시스템의 기기 매개변수는 90mW/cm2 (808nm 레이저)입니다.
  4. 실험이 완료되면 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.
    참고: 본 연구를 위해, 동물을 과량의 이소플루란32에 노출시켜 안락사시켰다.

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결과

물에 필요한 HLY1 도트의 형광 강도와 밝기는 NIR-II 이미징 기기에 의해 결정되었습니다. 90% fwTHF/H2O혼합물에서 HLY1의 형광 강도는 THF 용액의 5배였으며, 이는 HLY1의 두드러진 AIE 특징을 나타냅니다(그림 1B). 또한, HLY1 도트는 1,500nm LP 필터에서 강한 형광 신호를 방출하여 HLY1 도트가 NIR-IIb 이미징에 사용될 수 있음을 보여줍니다(그림 1D). HLY1 도트의 최대 흡수 및 최대 방출 파장은 각각 740nm 및 1,040nm였습니다(그림 2A). 또한, HLY1 도트의 유체역학적 크기는 동적 광 산란(DLS)에 의해 145nm로 측정되었습니다(그림 2B). HLY1 도트(0.2mL, 0.8mg/mL)를 혈...

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토론

NIR-I 형광 이미징은 종양 및 혈관 이미징에 어느 정도 사용될 수 있지만 NIR-I 형광단(<900nm)의 제한된 최대 방출 파장으로 인해 조직 침투 및 종양 신호 배경 비율이33,34가 불량합니다. 열악하고 낮은 이미징 해상도는 이미징 피드백 치료의 결과와 실제 치료 효과 사이에 편차를 유발할 수 있습니다. 또한, 대부분의 NIR-I 형광단은 광학 안정성이 낮고 대사가 매우 빠르기 때문에 이미징 공정이 불안정합니다. NIR-I 형광단의 낮은 조직 침투 및 불안정성으로 인해 종양 및 혈관 영상에서의 적용은 크게 제한된다35. NIR-I 광과 비교하여 NIR-II 형광 이미징은 광자 산란 및 흡수가 크게 감소하고, 조직 자동 형광이 낮고, 신체 조직 침투력이 강하고, 시공간 해상도가 더 우수하다는 장점이 있습니다.

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NSFC(82273796, 82111530209), 중앙 정부의 지역 과학 및 기술 개발 지도를 위한 특별 기금(XZ202202YD0021C, XZ202102YD0033C, XZ202001YD0028C), 후베이성 과학 기술 혁신 핵심 프로젝트(2020BAB058), 중앙 대학을 위한 기초 연구 기금, 과학 기술 개발을 위한 티베트 자치구 COVID-19 예방 및 통제 프로그램의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
무수 피리딘Perimed 110-86-1
무수 황산나트륨중국 국가 의약품 유한SY006376
검은 판지쑤저우 Yingrui 광학 기술 유한 회사AO00158
컬럼 크로마토 그래에너지 화학E080498
디 페닐 포스 핀 팔라듐 디클로라이드시그마 - 알드리치B2161-1g
DSPE - PEG2000PonsurePS-E1
Dulbecco의 개조된 독수리 미디엄 Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
소 태아 혈청Gibco2166090RP
이소 플루란GLPBIOGC45487-1
K < > 2 < / sub>CO 3 < / sub>MacklinP816305-5g
N. N '- 디메틸 포름 아미드중국 국가 의약품 유한1968
NIR-II 이미징 기기Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd16011109
N-sulfenanilideEnerry chemical 1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2TCI B2064-1g
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140-122
테트라하이드로푸란중국 국가 의약품 유한 M005197
테트라트리페닐포스핀 팔라듐Immochem1021232-5g
테트라트리페닐포스핀 팔라듐Sigma-Aldrich1021232-5g
트리부틸틴 클로라이드Immochem
트리메틸 클로로 실란중국 국가 의약품 유한 공사40060560
피 공사년 2월 12일 QH004335

참고문헌

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