방법 논문

Coherent Raman 현미경: 계측에서 응용 분야까지

DOI:

10.3791/64882

⸱

2023년 1월 20일

1Department of Chemistry, University of Washington

이 논문에서

초록

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논의 된 기사 :

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. 화학 이미징을 위한 초분광 유도 라만 산란 및 코히어런트 안티 스톡스 라만 산란 현미경의 직접 비교. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (182), E63677 (2022년)

De la Cadena, A. et al. 광대역 자극 라만을 기반으로 한 다중 화학 이미징

산란 현미경. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (185), e63709 (2022).

Shi, L., Wei, M., Min, W. 라만 염료를 사용한 고도 다중화 조직 이미징. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (182), e63547 (2022).

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. 조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 2색 자극 라만 산란 영상. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (180), e63484 (2022).

Miao, K., Lin, L. E., Qian, C., Wei, L. 부풀어 오른 조직의 진동 이미징 및 분석을 통해 가능한 Label-Free 초고해상도 이미징. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (183), e63824 (2022).

위안, Y., 루, F. 유도 라만 산란 현미경을 사용한 타임 랩스 라이브 셀 이미징을 위한 유연한 챔버입니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (186), e64449 (2022).

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. 이광자 형광과 유도 라만 산란 현미경을 결합한 생물학적 조직의 생체 내 이미징. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (178), e63411 (2021).

사설

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지난 10년 동안 세포 및 조직 이미징에 간섭성 라만 현미경(CRM)을 적용하는 데 대한 관심이 급증했습니다 1,2. CRM은 간섭성 반스토크스 라만 산란(CARS) 현미경과 유도 라만 산란(SRS) 현미경이라는 두 가지 인기 있는 변형이 있는 강력한 화학 이미징 기술입니다. SRS는 비라만 배경 간섭의 영향을 덜 받고 농도에 대한 선형 의존성을 갖기 때문에 CARS에 비해 점점 더 인기가 있습니다3. CRM은 라만 분광법과 유사한 분자 진동 정보를 수집하지만 획득 속도가 크게 향상되었습니다4. 이것은 피크 강도가 높은 한 쌍의 펄스 레이저를 통한 일관된 진동 여기에 의해 달성됩니다. CRM은 높은 공간 및 시간 해상도에서 공간적으로 분해된 화학적 매핑을 제공하기 때문에 암 진단, 지질 대사, 세포 대사, 약물 수송 및 기타 여러 분야에서 중요한 응용 분야를 발견했습니다 5,6,7,8. 그러나 이 기술의 광범위한 채택을 방해하는 주요 병목 현상 중 하나는 기술적 복잡성과 표준화된 프로토콜의 부족입니다. 상용 레이저와 현미경은 이미 사용 가능하지만 현재 현장에서 사용되는 거의 모든 시스템에는 레이저, 광학, 현미경 및 검출기의 다양한 수준의 맞춤화가 포함되어 있어 해당 분야에 진입하거나 이 기술을 채택하는 데 관심이 있는 연구자에게 상당한 장벽이 됩니다. 접근성 부족은 생물학적 적용을 더욱 방해합니다. 이 방법 수집의 목적은 기기, 새로운 이미징 접근법, 시험관/생체 내 세포 또는 조직 이미징 응용 분야에 대한 자세한 예와 지침을 제공하는 것입니다. 여기에 요약된 해당 분야 전문가의 7가지 출판물을 포함했습니다.

Clark et al. 감도, 공간 분해능 및 스펙트럼 분해능 측면에서 초분광 SRS와 CARS를 나란히 비교합니다9. 두 기술 모두 스펙트럼 처프 광대역 펨토초 레이저를 사용하여 협대역 라만 분해능을 달성하는 일반적으로 사용되는 접근 방식인 펨토초 레이저의 스펙트럼 포커싱으로 구현됩니다. 직접 비교를 통해 검출 차이를 평가하고 다양한 화학 이미징 응용 분야에 대한 양식을 최적으로 선택할 수 있습니다.

De la Cadena et al. 광대역 SRS 이미지를 빠르게 획득할 수 있는 새로운 멀티플렉스 SRS 방법을 발표했습니다10. 이 기술은 맞춤형 차동 다중 채널 잠금 증폭기 감지 (Custom Differential Multichannel Lock-in Amplifier Detection) 를 기반으로 하며, 이를 통해 최대 32 개의 채널을 동시에 감지 할 수 있습니다. 또한 상세한 노이즈 특성화가 표시되고 레이저 노이즈를 제거하기 위한 균형 잡힌 감지 방법이 시연됩니다. 이 프로토콜은 멀티플렉스 SRS 시스템 구축에 관심이 있는 사용자에게 실용적인 지침을 제공합니다.

Shiet al. SRS 이미징에서 고도로 다중화된 라만 염료의 사용을 보여줍니다11. 사전 공명 증강을 통해 SRS가 표준 면역형광에 필적하는 민감도를 제공할 수 있음을 입증합니다. 이 방법은 기존 면역형광에서 스펙트럼적으로 분해 가능한 채널의 한계를 우회하고 많은 단백질을 동시에 모니터링하고 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 이 강력한 방법의 채택을 용이하게 하기 위해 샘플 처리 및 라만 염료 염색에 대한 자세한 지침이 제공됩니다.

Miaoet al. SRS와 팽창 현미경을 결합한 초고해상도 이미징 기술인 부풀어 오른 조직의 진동 이미징 및 분석(VISTA)을 제시합니다12. VISTA는 형광 이미징과 관련된 장애물을 우회하고 최저 78nm의 공간 분해능으로 생물학적 샘플에서 라벨이 없는 초고해상도 체적 이미징을 달성합니다. 그들은 또한 딥 러닝 알고리즘을 활용하여 세포와 뇌 조직의 단백질 응집체를 포함한 다중 구성 요소 분할을 달성합니다.

Espinoza et al. 조직 진단 응용 분야를 위한 단백질 및 지질의 실시간 2색 SRS 이미징 사용을 제시합니다13. 2색 SRS 이미징은 병리학 응용 분야를 위한 H&E와 동등한 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 동시 2색 SRS 이미징을 위한 직교 변조 기술 및 스펙트럼 포커싱 구현에 대한 세부 사항을 설명합니다. 2색 SRS 이미지를 의사 H&E 이미지로 변환하는 것도 마우스 뇌 조직으로 시연되어 조직 진단 응용 분야를 설명합니다.

Yuan et al. 살아있는 세포의 장기 SRS 이미징을 위한 유연한 챔버 시스템을 발표합니다14. 기존 생세포 관찰 챔버의 대부분은 명시야 및 형광 이미징을 위해 설계되었습니다. 높은 NA 대물렌즈 및 콘덴서가 필요하기 때문에 SRS 감지와 호환되지 않습니다. 저자는 일정한 온도, CO2 및 습도를 유지하는 유연한 챔버를 사용하여 24시간 타임랩스 SRS 이미징을 시연합니다.

마지막으로, Wu et al. 동시 생체 내 2광자 형광(TPEF)과 SRS 이미징을 보여줍니다15. 두 개의 개별 레이저 시스템이 결합되어 보완적인 정보를 제공하기 위해 두 이미징 양식에 대해 최적의 감도를 달성합니다. 생체 내 조직의 SRS 이미징은 탈편광, 후방 산란광의 에피 검출이 필요하기 때문에 고유한 과제를 안고 있습니다. 이 프로토콜은 TPEF-SRS 현미경의 최적 설정에 대한 세부 사항과 마우스 척수의 생체 내 이미징에 사용할 수 있는 방법에 대해 설명합니다.

이 출판물 모음은 CRM 계측 및 기술 발전의 최신 기술을 나타냅니다. 분석법 개발과 응용 분야에 관심이 있는 연구자는 이 컬렉션이 설정을 비교하고 자체 시스템을 구성하거나 최적화하기 위한 벤치마크(감도, 분해능 등)를 설정하는 데 유용하다는 것을 알게 될 것입니다. 이러한 프로토콜에 제공된 지침과 모범 사례는 기존 및 미래의 시험관 내 및 생체 내 응용 분야에 정보를 제공할 것입니다. CRM 기술의 대규모 채택은 여전히 핵심적이고 혁신적인 애플리케이션과 완전한 CRM 솔루션의 상용화를 기다리고 있습니다. 그럼에도 불구하고 이미징 접근 방식과 벤치마크의 표준화는 재현성과 신뢰성을 보장하고 CRM16의 광범위한 구현을 촉진하는 데 필수적입니다.

CRM 분야는 빠른 속도로 성장하고 있습니다. 감도, 특이성 및 해상도 한계를 뛰어넘는 기술 개발은 계속해서 기술을 새로운 영역으로 이끌고 있습니다. 예를 들어, SRS의 공간 해상도는 회절 한계17,18을 초과하기 시작했습니다. 전자 사전 공진 SRS의 감도는 이제 형광19의 감도에 접근하고 있습니다. 형광과 비교할 때 CRM은 뚜렷한 장점을 가지고 있습니다. 예를 들어, 중수소 추적의 사용은 처음으로 세포 내 분해능에서 소분자의 대사 역학에 대한 생체 내 연구를 가능하게 했습니다20. 작은 태그를 사용하면 24개 이상의 표지된 표적(21)에 대해 고도로 다중화된 라만 검출을 수행할 수 있다. 인공 지능의 발전은 높은 정보 함량과 분자별 기능을 활용하여 미묘한 공간 및 스펙트럼 특징 차이가 있는 물체를 분할하고 분류함으로써 CRM의 새로운 기능을 가능하게 합니다22. CRM의 이러한 기술 발전은 생물학적 및 생물학적 이미징 모두에서 응용 분야를 가속화하고 확대할 준비가 되어 있습니다.

공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 미국 국립보건원(NIH R35 GM133435)과 Eli Lilly Young Investigator Award의 재정 지원을 인정합니다.

참고문헌

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  3. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: Beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
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  9. Clark, M. G., Brasseale, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct comparison of hyperspectral stimulated Raman scattering and coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for chemical imaging. Journal of Visualized Experiments. (182), e63677(2022).
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  12. Miao, K., Lin, L. E., Qian, C., Wei, L. Label-Free super-resolution imaging enabled by vibrational imaging of swelled tissue and analysis. Journal of Visualized Experiments. (183), e63824(2022).
  13. Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, two-color stimulated Raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (180), e63484(2022).
  14. Yuan, Y., Lu, F. A flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (186), e64449(2022).
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  21. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
  22. Manifold, B., Men, S., Hu, R., Fu, D. A versatile deep learning architecture for classification and label-free prediction of hyperspectral images. Nature Machine Intelligence. 3, 306-315 (2021).

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