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방법 논문

Measuring In Vivo Adipose Tissue Kinetics in Human(중수소(2시간)-라벨링 접근법을 사용한 인체의 In vivo Adipose Tissue Kinetics 측정

721 조회수

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DOI:

10.3791/64883

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2023년 7월 21일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

이 논문에서

요약

여기에 제시된 프로토콜은 중수소(2H) 라벨링 방법을 사용하여 인간의 생체 내 지방 조직 동역학을 측정하는 프로토콜입니다.

초록

백색 지방 조직은 전신 에너지의 항상성을 유지하는 데 필요한 고도의 가소성 기관입니다. 지방 조직 질량과 지방 질량 또는 분포의 변화는 지방 세포와 트리아실글리세롤의 합성 및 분해(즉, 회전율)의 변화에 의해 조절됩니다. 증거에 따르면 피하 지방 조직 확장(즉, 비대 대 과형성) 및 회전율의 방식과 크기가 대사 건강에 영향을 미칠 수 있으며, 지방 형성은 비만 및 관련 질병의 발병기전과 관련이 있습니다. 지방 회전율이 인체 건강에 미치는 잠재적인 역할에도 불구하고 지방 세포의 생체 내 동역학에 대한 지식은 부족합니다. 이는 부분적으로는 지방 조직에서 세포의 느린 회전율과 생체 내에서 세포의 대사 전구체를 직접 라벨링하는 실용적인 복잡성 때문입니다. 여기에서는 중수소(2H) 표지된 물의 소비를 통해 인간의 생체 내 지방 역학 및 회전율을 측정하는 방법을 설명합니다. pre-adipocytes 및 adipocytes에서 DNA의 deoxyribonucleotide 부분에 2H를 통합하면 세포 형성 및 사멸(지방 회전율)을 정확하게 측정할 수 있습니다. 전반적으로 이는 in vivo adipose kinetics를 측정하는 혁신적인 접근 방식이며 다른 in vitro 평가에서 실질적으로 벗어났음을 나타냅니다.

서론

비만은 과도한 백색 지방 조직(AT)을 특징으로 하는 질병으로, 제2형 당뇨병 및 심혈관 질환 발병의 중요한 위험 요인입니다1. 백색 AT는 트리아실글리세롤(TG) 형태로 에너지를 저장하는 고도의 가소성 기관으로, 대사 항상성에 필수적입니다2. 백색 AT는성인기에도 확장, 감소 및 리모델링할 수 있는 능력을 유지하며, 3, AT 질량은 지방세포 부피의 동적 변화(TG 합성 및 분해를 통해 ), 지방세포 전단계의 증식 및 분화를 통한 지속적인 지방세포 형성(즉, 증식 또는 지방형성), 지방 세포 사멸4에 의해 결정됩니다.

증거에 따르면 피하 AT 회전율(예: 지방 세포 형성 및 사멸)과 심장대사 건강 사이에 중요한 연관성이 있으며5,6,7,8 비만 관련 질환의 발병기전에서 지방 형성의 역할은 여전히 논란의 여지가 있습니다4. 그러나 인간의 in vivo AT 회전율에 대해서는 알려진 바가 거의 없는데, 그 이유 중 하나는 AT의 세포 구성 요소의 느린 회전율과 in vivo에서 대사 전구체를 직접 표지하는 복잡성 때문입니다. in vitro 방법은 몇 가지 통찰력을 제공했지만 이러한 접근 방식은 AT의 자연 환경 내에서 포괄적인 in vivo 평가를 제공하지 않습니다.

Hellerstein 실험실9에서는 중수(2H,2O)의 안정 동위원소 중수소(2H)를 AT(그림 1)에 통합하여 생체 내 AT 회전율을 평가하기 위해 방법을 개발했습니다(그림 1)10. 생쥐와 인간에서 검증된 이 프로토콜에는 체수분 농축을 2H증가시키기 위해 초기에 2H2O를 증가시키고, 그 다음에는 안정되고 안정기에 가까운 농축 값을 유지하기 위해 매일 적절한 섭취량이 포함됩니다. 2H2O (즉, 중수)의 2H는 지방 세포의 DNA에서 deoxyribonucleotides의 deoxyribose (dR) 부분에 통합되고, 동위 원소 농축은 질량 분석법 및 질량 동위 원소 분포 분석 (MIDA) 9,10,11의 적용을 통해 DNA에서 측정됩니다. DNA에서 퓨린 데옥시리보뉴클레오티드의 디옥시리보오스 부분을 안정한 동위원소 전구체로 라벨링하는 것은 피리미딘 뉴클레오티드 염기 부분(예: 3H-티미딘 또는 브로모-데옥시우리딘)으로 라벨링하는 것과 같은 이전 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 주목할 점은, DNA를 복제할 때 특히 피리미딘(pyrimidine)에 대한 염기의 내인성 재통합(endogenous reincorporation)은 이전에 표지 통합(label incorporation)의 해석을 혼란스럽게 만들었다는 점이다12. 또한, 안정 동위원소 표지를 dR에 통합하면 3H(트리튬) 또는 브로모-데옥시우리딘과 같은 방사성 또는 유전독성 제제의 통합과 달리 유전독성을 일으키지 않습니다. 따라서 동물 모델과 인간에서 이 기술을 장기간 사용하는 것은 안전합니다.

2H-labeled DNA synthesis의 측정은 세포 분열의 S-단계를 통한 세포의 이동을 의미하며 새로 형성된 pre-adipocyte 및 adipocyte(pre-adipocyte 분화를 통해) 또는 adipogenesis13을 식별합니다. 급격한 회전율을 겪는 세포(예: 단핵구)는 DNA를 빠르게 대체하고 2H-농축에서 고원에 도달하여 분석을 위한 내부 참조를 제공합니다. 지방 세포의 DNA가 단핵구(참조 세포)의 비율에 비해 2 H-농축 비율 또는 통합체 2H2O 측정을 통해 새로 합성된 지방 세포의 분율을 계산할 수 있습니다. 본 명세서에서, 본 프로토콜은 음성 면역 선택을 통해 지방 세포를 정제하고 지방 세포 전 집단을 풍부하게 하는 정교한 기술을 포함하여 2H 대사 표지 프로토콜을 통해 인간의 생체 내 지방 세포 회전율(지방 형성) 속도를 측정하는 방법을 설명합니다14.

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프로토콜

Pennington Biomedical Research Center의 IRB(Institutional Review Board)는 모든 절차(#10039-PBRC)를 승인했으며 모든 인간 피험자는 서면 동의서를 제출했습니다.

1. 8 주 2H2O 라벨링 기간

  1. 70% 또는 99.9% 중수소 표지 물(2H2O)의 분취액을 멸균 플라스틱 용기에 투여합니다.
  2. 참가자들에게 99.9% 농축 2H2O 35mL 용량 또는 70% 농축 2H2O 40mL 용량을 1주차(프라이밍 기간)에 하루 3회 마시고 2-8주차에 하루에 각각 35mL 또는 50mL 용량을 2회 마시도록 지시합니다.
    참고: 일시적인 현기증이나 현기증은 2H2O 섭취의 유일한 알려진 부작용이며 내이의 모낭에서 감지되는 벌크 물 흐름의 급격한 변화와 관련이 있습니다. 따라서 참가자들에게 일시적인 현기증이나 현기증의 드문 발생을 피하기 위해 최소 ~2시간 간격으로 복용량을 복용하도록 지시합니다15. 같은 이유로, 1회 복용량을 두 배로 늘려 놓친 복용량을 보충하지 마십시오. 상기한 바와 같이 투여량(≥2시간으로 구분)을 투여하면 인간 피험자(수백 명의 피험자 중 <1%)에서 이 부작용이 극히 드물게 됩니다.
  3. 소변 채취를 통한 2H2O 섭취량 준수 여부를 모니터링하여 체수분의 2H 농축을 측정하고 계산을 위해 매주 빈 바이알을 반환합니다.
    1. 활성탄과 필터를 사용하여 소변 샘플을 청소합니다.
      1. 활성탄 1mL와 함께 10mL 튜브에 소변 8mL를 추가합니다.
      2. 샘플을 로커에 10분 동안 놓고 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 숯이 튜브 바닥으로 이동하도록 합니다. 0.2μm 실린지 필터로 샘플을 필터링합니다.
    2. 동위원소 비율 질량 분석법(IRMS)으로 체수분(소변)의 2H2O 농축을 측정합니다.
      참고: 2H2O 농축은 가스 크로마토그래피-질량 분석기16, IRMS17과 결합된 고온 변환 원소 분석기(TC/EA), 캐비티 링 다운 적외선 분광법(IRIS)18 또는 질량 분석기(예: IRMS)19에 부착된 H/장치를 포함한 다양한 방법으로 분석할 수 있습니다.
    3. 8주간의 라벨링 기간 동안 소변에서 측정된 평균 2H2O 농축을 사용하여 전구체 2H2O 노출과 새로 합성된 AT 세포의 분율을 계산합니다(아래 섹션 7 및 섹션 8 참조).

참고: 2H2O 라벨링 프로토콜은 8주 라벨링 기간 동안 1.0%-2.5% 범위 내에서 체수분의 거의 정체 2H농축을 유지합니다(그림 2)10.

2. 인간 피험자로부터의 지방 조직 생검 수집

  1. 포비돈 요오드 용액으로 피부를 세안한 후 국소 마취(예: 2% 리도카인/0.5% 부피바카인)를 투여하고 피부를 ~0.75cm 절개한 다음 멸균 조건에서 바늘 지흡인 기술을 통해 피하 AT 생검을 채취합니다13.
  2. 5mL의 실온(RT) 1M HEPES 완충액, pH 7.3을 포함하는 멸균 50mL 튜브의 무게를 잰다. 처리를 위해 HEPES 버퍼가 있는 튜브에 AT를 즉시 넣습니다.
  3. AT가 들어있는 50mL 튜브의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다.

3. 순화된 adipocytes의 고립

  1. 유형 1 콜라겐 분해 효소 / HEPES (2mg / mL) 용액을 2g / mL AT에 첨가합니다.
  2. 37°C에서 1시간 동안 진탕(100rpm)으로 수조에서 몇 개의 크고 손상되지 않은 AT 조각과 균질한 혼합물이 될 때까지 배양하여 AT를 소화합니다.
  3. RT에서 8분 동안 500 x g 의 튜브를 원심분리하여 지방 세포와 기질-혈관 분획(SVF)을 분리합니다.
  4. 상단 지방층(지방 세포)을 부드럽게 제거하고 별도의 튜브로 옮깁니다. 튜브 바닥의 펠릿(SVF)을 방해하지 마십시오.
  5. 앞서 설명한바와 같이 14, 면역자기 세포 분리를 사용하여 지방 세포를 정제합니다.
    참고: 이 중요한 단계는 조혈구, 내피 세포 및 줄기 세포를 포함하여 세포 회전율이 빠른 다른 세포 유형이 부유 지방 세포에 달라붙어 측정에 영향을 미칠 수 있으므로 지방 세포를 "청소"하기 위해 수행됩니다.
    1. 음성 면역 정제를 위해 ~400 μL의 지방 세포를 5 mL 튜브에 넣습니다.
    2. FcR 차단 항체(100μL/mL)를 추가합니다.
    3. RT에서 15분 동안 지방 세포 용액에 내피 세포(anti-human CD31, 1:100), 조혈 세포(anti-human CD45, 1:400) 및 중간엽 줄기 세포(anti-human CD34, 1:100)의 마커에 대한 비오틴화 항체 칵테일을 추가합니다.
    4. 지방 세포 용액에 비오틴 선택 칵테일(100 μL/mL)을 추가하고 잘 혼합한 후 RT에서 부드러운 틸팅/회전으로 15분 동안 배양합니다.
    5. 자성 나노 입자를 위아래로 피펫팅하여 혼합하고, 입자(50μL/mL)를 지방 세포 용액에 첨가하고, 잘 혼합한 후 RT에서 부드러운 회전(10rpm)으로 10분 동안 배양합니다.
    6. 총 부피 1mL에 대해 지방 세포 용액에 PBS/2% FBS/1mM EDTA 완충액을 추가합니다.
    7. 튜브를 자석에 넣고 5분 동안 그대로 두십시오.
    8. 자석을 들고 한 번의 연속 동작으로 튜브가 들어 있는 자석을 뒤집고 내용물을 새 5mL 튜브에 붓습니다. 붓는 동안 튜브를 두드리지 마십시오. 항체에 부착된 세포는 자성 나노입자에 의해 결합되어 제거되는 반면, 면역 정제된 지방 세포는 유지됩니다.
    9. 정제된 지방세포를 액체 N2에 급속 동결하고 DNA가 추출될 때까지 -80°C에서 보관합니다.

4. pre-adipocytes의 분리

  1. 풍부한 지방세포(pre-adipocyte) 집단을 분리하기 위해, SVF20의 단기 배양 후 플라스틱에 부착하는 능력을 활용하는 프로토콜을 채택한다.
  2. 층류 후드에서 SVF 펠릿을 5mL의 적혈구 용해 완충액에 RT에서 5-10분 동안 재현탁하고(완전히 혼합) 800 x g에서 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 펠릿을 알파(α)MEM의 10% FBS에 재현탁합니다.
  3. 조직 배양 인큐베이터에서 37°C와 5% CO2 대기로 8-12시간 동안 플라스틱 배양 접시에 세포를 플레이트화합니다.
  4. ~8-12시간 후, 층류 후드 내부의 PBS로 배양판에서 비부착성 세포를 부드럽게 세척합니다.
  5. PBS를 흡인시킨 후 배양 접시에 0.25% 트립신/1mM EDTA 1-1.5mL를 첨가하여 부착 세포(사전 지방세포의 농축 집단)를 분리합니다. 세포를 들어 올리는 데 도움이 되도록 37°C의 인큐베이터에 ~5-8분 동안 배양 접시를 놓습니다.
  6. 플레이트에 10% FBS/αMEM을 추가하고 플레이트를 철저히 세척하여 플레이트에서 모든 세포를 수집합니다. 세포 용액을 15mL 또는 50mL 튜브로 옮기고 800 x g 에서 8분 동안 원심분리합니다.
  7. 상등액을 제거하고, DNA 적출까지 -80 °C에 펠릿 (pre-adipocytes)를 저장하십시오.

5. 혈액 단핵구의 분리

참고: 단핵구는 (거의) 완전히 뒤집힌 세포 집단을 나타내는 것으로 분석되며, 단핵구의 2H 농축 측정은 각 개인에서 2H2O 노출의 참조 마커로 사용될 수 있습니다. 대안적으로, 몸체2H2O농축을 측정하고2H2O노출을 계산하는데 사용할 수 있다.

  1. 인간 피험자의 신선한 전혈을 EDTA가 들어 있는 진공 튜브로 채취합니다.
  2. 1,000-2,000 x g 에서 4 °C에서 15분 동안 혈액을 원심분리한다.
    알림: 브레이크를 사용하지 마십시오.
  3. 플라즈마의 최상층을 제거합니다. 플라즈마 바로 아래에 있는 흰색 담황색 털을 만지지 않도록 주의하십시오.
  4. 전사 피펫을 사용하여 흰색 버피 코트를 흡인하고 50mL 튜브로 옮깁니다. 버피 코트에 ~10mL의 PBS를 추가합니다.
  5. 밀도 그라디언트 배지 10mL를 부드럽게 첨가하여 버피 코트를 겹겹이 쌓습니다.
    알림: 피펫 끝이 튜브 바닥에 닿는지 확인하고 바닥에 밀도 구배 매체의 깨끗한 층이 있도록 조심스럽게 배출합니다. 거품을 도입하지 마십시오.
  6. 브레이크를 끈 상태에서 800 x g 에서 튜브를 30분 동안 원심분리합니다.
  7. 백색 층(단핵 분획)을 피펫으로 빼내고(~10mL) 전사 피펫의 끝이 경계에 가깝게 원을 그리며 이동하지만 상부 층에는 닿지 않습니다. 새 50mL 튜브로 옮기고 PBS 10mL를 추가합니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 사용하고(브레이크를 사용하지 마십시오) 상층액을 폐기합니다.
  8. 펠렛에 적혈구 용해 완충액 5mL를 추가합니다. 섞어서 RT에서 2분 동안 그대로 두십시오.
  9. 적혈구 용해 완충액/펠릿 용액에 0.1% BSA가 함유된 PBS 5mL를 첨가하고 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
  10. 면역 자성 비드를 사용하여 단핵구를 CD14+ 세포로 분리합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 CD14+ 셀의 분리를 수행합니다.
  11. DNA 추출까지 분리된 단핵구를 -80°C에서 보관하십시오.

6. DNA 준비(분리, 가수분해 및 유도체화)

  1. 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용하여 pre-adipocytes, adipocytes 및 blood monocytes에서 DNA를 분리합니다.
  2. 디옥시리보뉴클레오시드를 제거하려면, 16 mm x 100 mm(10 mL) 나사로 덮인 유리관에 1 mL의 S1 nuclease, 1 mL의 phosphatase 효소 및 36.8 mL의 5x 가수분해 완충액을 함유한 50 μL의 효소 가수분해 칵테일에서 37 °C에서 하룻밤(24시간 이하) DNA(~200 μL)를 효소로 가수분해합니다. 또한 물 블랭크, 가수분해 칵테일 블랭크, DNA 추출 키트의 컬럼 블랭크 및 500ng의 DNA 표준물을 포함합니다.
    1. 5x 가수분해 완충액을 준비하려면 분자 생물학 등급의 순수한 물 94mL를 멸균 비커에 넣습니다. 아세트산나트륨 3.08g과 황산아연 21.5mg의 무게를 달고 물을 넣고 녹을 때까지 섞습니다. 빙초산으로 pH를 5.0으로 조정하고 pH 종이를 사용하여 테스트합니다. 총 부피가 100mL가 되도록 물을 추가합니다.
    2. 인산가수분해효소를 준비하려면 산성 인산가수분해효소 바이알을 1mL의 순수한 물에 재현탁합니다.
    3. 0.5 U/μL S1 nuclease enzyme을 준비하려면 2.5 μL의 S1 nuclease를 2 mL의 1x 가수분해 완충액으로 희석합니다(1 mL의 5x 가수분해 완충액을 4 mL의 순수한 물에 첨가).
  3. 가수분해물을 펜타플루오로벤질히드록실아민(PFBHA) 유도체로 유도체화합니다. 구체적으로, 16 mm x 100 mm (10 mL) 스크류 캡 튜브에 있는 표준물질 및 블랭크를 포함하여 분해된 DNA 샘플에 다음을 직접 첨가합니다: 100 μL의 펜타플루오로벤질 하이드록실아민 하이드로클로라이드(PFBHA; 1 mg/mL) 및 75 μL의 빙초산. Vortex(간략히), 바이알의 뚜껑을 씌우고 가수분해물 샘플을 100°C로 설정된 가열 블록에 30분 동안 놓습니다.
  4. 샘플을 제거하고 RT까지 ~5분 동안 식히십시오. 냉각 후 무수아세트산 2mL와 1-메틸이미다졸 100μL를 흄 후드 아래의 각 튜브에 추가합니다. 튜브를 100°C 가열 블록에 5분 동안 설정합니다.
  5. 샘플을 제거한 다음 ~15-20분 동안 식히십시오. 식으면 각 샘플에 분자 생물학 등급의 물 3mL를 넣고 잠시 소용돌이친 다음 10분 동안 그대로 둡니다.
  6. 튜브에 2mL의 디클로로메탄(DCM)을 첨가하고 샘플을 15초 동안 격렬하게 와류로 처리하여 유도체를 유기상으로 추출합니다.
  7. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 상을 분리합니다. 바닥 디클로로메탄 층을 깨끗한 1.6mL GC 바이알에 조심스럽게 옮깁니다.
    참고: 수성 상을 전달하면 배경이 증가하므로 전달하지 마십시오.
  8. 질소로 ~20분 동안 건조될 때까지 증발하여 DCM과 잔류 아세트산을 제거한 다음 RT에서 고속 진공에서 ~10분 건조하여 시약의 모든 흔적을 제거합니다.

7. DNA의 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS) 분석

  1. 건조되면 PFBHA 유도체를 150μL의 에틸 아세테이트에 재현탁시키고 캡을 씌웁니다. 다음으로, 메탄 네거티브 화학 이온화를 사용하여 DB-225 컬럼이 장착된 가스 크로마토그래피(GC)/질량 분석법(MS) 기기에서 2H의 DNA에 통합되는 것을 분석하고 m/z 435, m/z 436 및 m/z 437(M0,M1 및M2 질량 동위원소체를 나타냄)에서 선택적 이온 모니터링 모드에서 이온을 수집합니다. 각기). 사용하는 기기에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
    1. GC 조건을 다음과 같이 설정하십시오 : 열 : 30m x 0.25mm ID x 0.25μm 필름 코팅; 크로마토그래프: 1.0mL/min 일정한 유량의 헬륨 운반 가스; 펄스 스플릿리스 주사; 인젝터 온도: 250 °C; MS 이송 라인: 325°C; 오븐 조건: 초기 온도 100°C, 2분 유지, 램프amp 40°C/분에서 220°C의 온도로, 7.5분 유지, 두 번째 램프amp 40°C/분에서 320°C까지, 1분 동안 유지합니다. 총 런타임은 16.0분입니다. 일반적인 dR 용리 시간은 첫 번째 및 두 번째 피크에 대해 각각 10.5분 및 10.8분입니다.
    2. MS 조건을 다음과 같이 설정합니다: 단일 이온 모니터링 모드에서 검출되는 메탄 음성 화학 이온화 소스; dR에 대해 수집된 이온: m/z 435, m/z 436 및 m/z 437(각각 M0, M1 및 M2 질량 동위원소를 나타냄).
      알림: 라이너 하단 부분에 있는 실리콘화된 유리솜의 작은 플러그로 열린 유리 라이너를 실리콘화합니다. 이 라이너를 자주 교체하십시오(~100회 주입마다).
  2. 다음과 같이 비농축(자연 풍부) dR 도함수에서 질량 동위원소 존재비 M1 비율을 계산합니다.
    M1 비율 = M1 풍부도/(M0, M1 및 M2 풍부도의 합)
    그런 다음 라벨링된 샘플의 dR에서 M1 비율에서 자연 존재비 M1 비율을 빼서 농축(초과 동위원소 존재량 또는 %EM1)21을 계산합니다.
  3. 분석된 샘플의 M0 이온 풍부도 범위에 걸쳐 있는 M0 이온 존재비 범위에 대해 기준선(비농축) DNA 표준물질의 질량 동위원소 존재농도를 동시에 측정합니다.
    참고: 이 단계는 GC/MS22로 측정된 동위원소 비율의 "존재비 민감도"를 수정하는 데 필수적입니다.
  4. 라벨링되지 않은 표준물질에서 측정된 M0 이온 함량 대 측정된 질량 동위원소 M1 비율의 그래프를 구성하여 M1 질량 동위원장에 대해 가장 정확한 컬럼 내 시료 농도를 측정합니다(즉, 알려진 계산된 자연 존재도 M1 비율 또는 "스위트 스폿"에 가장 가까운 위치). 이 비농축 dR 도함수에 대한 M1 비율은 0.1669입니다.
  5. M0 피크 영역에서 이 "스위트 스폿"에 최대한 가깝게 실험 샘플을 주입합니다. 비농축 표준물질 대 M0 피크 면적의 M1 비율의 2차 회귀 분석을 사용하여 특정 M0 농도에서 각 샘플에 대한 "조정된 자연 존재비" M1 비율을 추정합니다. 지방 세포 샘플 M1 비율에서 이를 빼면 자연 풍부도보다 높은 농축 비율 또는 %EM1(그림 3)23을 얻을 수 있습니다.
  6. 8주 동안 통합된 신체 2H2O 노출(소변에서 측정됨)(그림 4) 또는 중간 측정된 단핵구 농축(7.5단계)을 기반으로 질량 동위원소 분포 분석(MIDA) 방정식24를 사용하여 지방 세포의 이론적 최대 M1 농축(EM1*)을 계산합니다.

8. 새로 합성된 세포의 분획 계산 또는 생체 내 지방 형성

  1. 다음 공식을 사용하여 생체 내 지방 형성 또는 새로 합성된 사전 지방 세포 또는 지방 세포의 형성을 측정하는 새로운 세포의 분율(%)을 계산합니다.
    새로운 세포의 분율(%) = [(시료[지방] 세포의 M1 농축)/EM1* (이론적 최대 M1 농축)] x 100
    참고: *단핵구의 2H농축은 방정식의 분모로 사용될 수도 있습니다. 단핵구에서의 이러한 측정은 각 개체에서 2H2O 노출의 기준 세포 마커를 나타내며, 측정된 신체 2H2O 값으로부터 이론적 최대 M1농축의 계산을 확인하는 데 사용될 수 있습니다.

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결과

2H2O 라벨링 프로토콜(섹션 1)은 그림 2와 같이 8주간의 라벨링 기간10 동안 1.0%-2.5% 범위 내에서 체수분 내 2H 농축에 가까운 고원량을 유지합니다. 이전 연구에서는 섹션 2-8에 자세히 설명된 바와 같이 지방 세포의 DNA에 2H 를 통합하여 지방 동역학을 평가하기 위해 2H2O 라벨링 프로토콜을 사용했으며, 비만 여성의 피하 복부(scABD) 창고에 비해 대퇴골하(scFEM)에서 생체 내 지방 형성(지방 세포 증식 전 및 지방 세포 형성 모두)이 더 높다고 보고했습니다(그림 5)13. 추가 데이터에 따르면 피하 AT 저장소의 지방 세포 전단계 및 지방 세포 형성률은 전체...

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토론

체외 평가는 AT의 자연 환경을 포함하지 않기 때문에 백색 AT 회전율의 역학과 비만 및 관련 대사 질환에서의 역할에 대한 새로운 지식을 제공하기 위해 생체 내 평가가 필요합니다. 지방 역학을 평가하기 위해 후향적 방사성탄소 연대측정법을 사용하는 것이 유익하기는 하지만, 7,25 이 방법은 전향적 중재 연구에서 역동적인 변화를 포착하는 데에는 적합하지 않습니다. 2H 라벨링 방법은 인간의 생체 내 지방 세포 형성 및 회전율에 대한 생리학적 측정을 제공하는 것으로 검증되었으며 다른 평가에서 실질적으로 벗어났음을 나타냅니다. 최근 몇 년 동안 이 접근 방식은 설치류 26 와 인간13 , ...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-메틸이미다졸MilliporeSigma336092
2H2OSigma Aldrich
아세트산 무수물Aldridge539996
ACK 용해 완충액 (적혈구 용해 완충액)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS 애질런트
항 인간 CD31 (PECAM-1) 비오틴인비트로젠13-0319-82
항 인간 CD34 비오틴인비트로겐13-0349-82
항 인간 CD45BioLegend304004
항생제 항진균 용액MilliporeSigmaA5955
콜라겐 분해 효소 유형 1Worthington Biochemical CorporationLS004196
Deoxyribose (2-deoxy d-ribose)MilliporeSigma31170
Deuterium OxideMilliporeSigma756822
DB-225 컬럼 (30m, 0.25mm, 0.25um)J& W Scientific122-2232
디클로로메탄(DCM)MilliporeSigma34856
DNA 표준(송아지 흉선 DNA)MilliporeSigmaD4764
Dneasy 혈액 및 조직 키트(DNA 추출 키트)Qiagen69504
Easy Sep Human Biotin KitStem Cell Technologies17663
EasySep Human CD14 Positive Selection CocktailStem Cell Technologies18058C
에틸 아세테이트FisherEX0241-1
Falcon 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관VWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
GC 바이알 (2 mL)FisherC-4011-1W
GC 바이알 인서트FisherC-4011-631; C-4012-530
빙초산FisherAC14893-0010
유리관(가수분해용)Fisher14-959-35AA
HEPES 완충액ThermoFisher15630080
Hyclone Water, 분자생물학 등급Thomas ScientificSH30538.02
MEM alphaFisher Scientific32561-037
PFBHA (o- (2, 3, 4, 5, 6) - penatfluorobenzylhydroxylamin hydrochloride)MilliporeSigma194484
pH 지시자 스트립Fisher987618
Phosphatase acidCalbiochem (VWR)80602-592
S1 nuclease (Aspergillus oryzae 유래)MilliporeSigmaN5661
황산나트륨MilliporeSigma23913

참고문헌

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