현재 연구는 실시간 세포 분석(RTCA) 시스템을 사용하여 바이러스 감염 중 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
내피 세포는 모든 혈액 및 림프관의 내부 표면을 감싸고 혈액 또는 림프액과 주변 조직 사이의 체액 및 용질 교환을 조절하는 반투과성 장벽을 만듭니다. 바이러스가 내피 장벽을 통과하는 능력은 인체에서 바이러스 확산을 촉진하는 중요한 메커니즘입니다. 많은 바이러스가 감염 시 내피 투과성을 변화시키거나 내피 세포 장벽 파괴를 일으켜 혈관 누출을 일으킬 수 있는 것으로 보고되고 있습니다. 현재 연구는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 지카 바이러스(ZIKV) 감염 중 내피 무결성 및 투과성 변화를 모니터링하기 위해 상용 실시간 세포 분석기를 사용하는 실시간 세포 분석(RTCA) 프로토콜을 설명합니다. ZIKV 감염 전후에 기록된 임피던스 신호를 세포 지수(CI) 값으로 변환하여 분석했습니다. RTCA 프로토콜을 사용하면 바이러스 감염 중 세포 형태학적 변화의 형태로 일시적인 효과를 감지할 수 있습니다. 이 분석은 다른 실험 설정에서 HUVEC의 혈관 무결성 변화를 연구하는 데에도 유용할 수 있습니다.
서론
내피 세포(EC)는 모든 혈액 및 림프관의 내부 표면을 둘러싸고 있습니다. 이들은 부착체, 단단한 간극 연접으로 연결되어 혈액 또는 림프와 주변 조직 사이에 반투과성 장벽을 만듭니다 1,2. 온전한 내피 세포-세포 접합부는 거대분자, 용질 및 체액의 수송을 조절하는 데 중요하며, 해당 조직과 기관의 생리적 활동에 매우 중요합니다3. 내피 장벽은 역동적이며 특정 자극에 의해 조절된다4. 내피 장벽 기능의 붕괴 또는 상실은 바이러스 감염을 포함한 많은 질병 5,6,7의 발병기전에서 급성 및 만성 염증에서 질병 병태생리학의 특징이다 8,9,10,11. 플라비바이러스의 경우, 비구조적 단백질인 NS1이 카텝신 L, 시알....
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프로토콜
1. 세포 준비
- HUVEC의 준비
- HUVEC의 배양에 필요한 성장 인자, 호르몬 및 단백질을 함유한 10% 소 태아 혈청(FBS), 0.01% 내피 세포 성장 보충제(ECGS)가 보충된 12mL의 내피 세포 배지(ECM)를 함유한 75cm2(20μg/mL 콜라겐 유형 1로 코팅됨) 세포 배양 플라스크에 7.5 x 105 HUVEC 세포/mL를 성장시킵니다. 및 0.01% 페니실린-스트렙토마이신(P/S). 5%CO2를 사용하여 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다(그림 1).
2. RTCA 실험 설정
- RTCA에서 실행되는 저항기 검증
- 바탕 화면에서 RTCA 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 응용 프로그램을 시작합니다. 로그인 창이 나타나면 사용자 이름과 비밀번호를 입력하여 로그인합니다.
- A96 웰이 안쪽을 향하도록 1웰 RTCA 저항 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 있는 RTCA 스테이션에 놓습니다. ....
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결과
ZIKV 감염 전, 특수 금미세전극 코팅 마이크로타이터 플레이트에서 배양한 HUVEC 단층에 대해 기록된 CI는 8 이상이었으며, 이는 강력한 부착 특성을 시사합니다. CI 지수가 8 미만인 플레이트 또는 웰은 폐기해야 합니다. 그런 다음 HUVEC을 0.1 및 1의 MOI에서 ZIKV에 감염시키고 세포 임피던스를 7일 동안 기록했습니다. MOI 0.1(연한 파란색 선)에서 ZIKV P6-740에 감염된 HUVEC의 CI 값은 감염 후 15시간(HPI)에 떨어지기 시작했으며, 음성 감염 대조군(갈색 선; 그림 4). MOI 1(파란색 선)에서 고용량의 ZIKV P6-740에 감염된 HUVEC의 경우, CI 값은 11 HPI부터 떨어지기 시작했습니다. 24 HPI에서 EC가 각각 0.1 및 1의 MOI에서 ZIKV에 감염되었을 때 정규화된 CI 값(0.949, 0.929)이 5% 및 7% 감소했습니다. 정규화된 CI 값의 50% 감소는 각각 0.1 및 1의 MOI에서 ZIKV .......
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토론
관대한 세포에서의 세포제 바이러스 감염은 일반적으로 세포 형태 및 생합성의 상당한 변화와 관련이 있다36. 세포 수축, 세포 확대 및/또는 세포융합 형성과 같은 바이러스에 의한 세포 형태학적 변화는 세포병증 효과(cytopathic effect, CPE)라고도 하며, 특정 바이러스 감염에 특징적이다37. EC에서, CPE는 세포의 파괴 및 각 EC 사이의 단단한 접합부의 파괴로 설명되었으며, 따라서 내피 장벽(38,39)의 파괴를 유발했다. HUVEC의 CPE는 단층 세포 분리 및 조직 배양 용기에서 떠다니는 것으로 설명할 수 있습니다. 부착 세포의 분리 및 부유와 같은 감염된 세포 형태학적 변화는 RTCA 방법을 사용하여 지속적으로 검출할 수 있습니다. 이 기술은 최대 몇 초마다 실시간으로 셀을 모니터링할 수 있는 전기 임피던스를 기반으로.......
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공개 사항
저자는 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
이 연구는 HICoE(Higher Institution Centre of Excellence) 프로그램(MO002-2019)에 따라 말레이시아 고등교육부의 지원을 받았으며 장기 연구 보조금 제도(LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018)에 따라 자금을 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Nest | 615601 | |
| 37 ° C 인큐베이터와 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 조직 배양 플라스크 | Corning | 430725U | |
| 항생제 용액 페니실린-스트렙토마이신(P/S) | Sciencell | 0503 | |
| 생물학적 안전 캐비닛, Class II | Holten | HB2448 | |
| 콜라겐 유형 1 | SIGMA-Aldrich | C3867 | |
| 내피 세포 성장 보조제(ECGS) | Sciencell | 1052 | |
| 내피 세포 배지(ECM) | Sciencell | 1001 | |
| E-플레이트 96 | 애질런트 테크놀로지스, Inc. | ||
| 소 태아 혈청(FBS) | Sciencell | 0025 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | |
| 혈구계 | Laboroptik LTD | Neubauer 개선 | |
| 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) | Sciencell | 8000 | |
| 도립 현미경 | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 노트북 | Dell | - | |
| 멀티채널 마이크로피펫(10 - 100 &마이크로; L) | Eppendorf | 3125000036 | |
| 멀티채널 마이크로피펫 (30 - 300 &마이크로; L) | Eppendorf | 3125000052 | |
| 시약 예비 | Tarsons | T38-524090 | |
| RTCA 저항기 플레이트 96 | Agilent Technologies, Inc. | ||
| RTCA Software Pro (버전 2.6.1) | Agilent Technologies, Inc. | ||
| 싱글채널 피펫(10 - 100 &마이크로; L) | Eppendorf | 3123000047 | |
| 싱글 채널 피펫 (100 - 1000 µ L) | Eppendorf | 3123000063 | |
| 싱글 채널 피펫 (20 - 200 µ L) | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence 실시간 세포 분석기 SP (모델: W380) | Agilent Technologies, Inc. | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
참고문헌
- Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
- Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-34....
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재인쇄 및 허가
