방법 논문

단백질 구조 측정을 위한 Cryo-EM 분석의 최근 발전 및 모범 사례

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DOI:

10.3791/64907

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2023년 2월 10일

 , 
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, King’s College London, 2Bio Structure and Biophysics (BSB), Sanofi

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. 지지 부양 블록을 사용한 투과 전자 현미경에서 샘플 지지 필름의 준비. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (170), doi:10.3791/62321 (2021).

Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. 시간 분해 극저온 전자 현미경을 위한 빠른 그리드 준비. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (177), doi:10.3791/62199 (2021).

Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. 새로운 로봇 시스템인 Spotiton을 사용한 시간 분해 연구를 위한 Cryo-Electron 현미경 그리드 준비. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (168), doi:10.3791/62271 (2021).

Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A., Jr. 단일 입자 극저온 전자 현미경을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (180), doi:10.3791/62765 (2022).

Martynowycz, M. W., Gonen, T. 소분자의 미결정 전자 회절. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (169), doi:10.3791/62313 (2021).

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, JB, Fleck, RA 초저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리질 생물학적 샘플에서 라멜라를 준비합니다. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (174), doi:10.3791/62350 (2021).

Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, CryoEM 실험을 위한 정보 관리 시스템. 시각화 실험 저널(Journal of Visualized Experiments). (172), doi:10.3791/62377 (2021).

사설

직접 전자 검출기의 출현과 소프트웨어 및 하드웨어의 개선 이후 극저온 전자 현미경(cryo-EM)은 연구자들이 원자에 가까운 거대 분자의 구조를 일상적으로 결정할 수 있는 기술이 되었습니다 1,2. 이러한 가속화는 샘플 준비에서 데이터 수집 및 처리에 이르기까지 매우 빠르게 진행되는 일련의 새로운 개발에 의해 촉매되었습니다. 비전문가에게도 이 기술을 광범위하게 민주화할 수 있도록 보다 효율적이고 접근 가능한 파이프라인이 만들어졌습니다. 놀랍게도 "분해능 혁명" 이후 10년도 채 되지 않아 cryo-EM은 학계와 산업 모두에서 단백질 특성화에 필수적인 기술이 되었습니다 3,4.

cryo-EM 연구 커뮤니티의 가장 주목할만한 측면 중 하나는 프로토콜, 전략 및 소프트웨어를 공개적으로 공유하려는 의지였습니다5. 이러한 기술과 전문성의 개방성은 매우 빠른 개발 속도에 크게 기여했지만 일부 병목 현상으로 인해 완전히 액세스할 수 없습니다. 이 방법 모음에서 우리는 데이터 분석 하드웨어에 대한 액세스와 함께 많은 프로젝트의 주요 병목 현상인 cryo-EM에 의한 구조 분석에 적합한 그리드 준비의 최근 개발 중 일부를 설명하는 것을 목표로 합니다. 또한 cryo-EM 분석의 새로운 접근 방식을 위해 현재 이 분야에서 개발 중인 새로운 프로토콜에 대해서도 논의합니다.

위에서 언급했듯이 실험실에서 cryo-EM을 일상적으로 적용하는 현재 병목 현상 중 하나는 샘플 준비입니다. 그리드에 대한 샘플 적용 수준에서 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다: 가장 일반적으로 얼음에서 샘플의 선호 방향과 공기-물 계면에서의 변성입니다. 공기-물 계면으로부터 시료를 차폐하는 것은 시료가 공기와 접촉하는 것을 물리적으로 방지하는 탄소 또는 그래핀 지지 필름을 사용하여 이 문제에 대한 한 가지 해결책입니다. 박막을 그리드에 쉽게 적용하기 위해 de Martin Garrido 등6 은 작은 물방울과 샘플을 제어된 방식으로 적용할 수 있는 3D 프린터로 생산된 지지 부유 블록을 개발했습니다. 이 블록을 사용하여 그래핀과 탄소층이 저렴하고 사용자 친화적인 방식으로 증착됩니다.

공기-물 계면의 손상을 방지하는 또 다른 방법은 단백질이 대기에 노출되는 시간을 제한하는 것입니다. 이를 위해 Klebs et al.7 과 Budell et al.8이 개발한 두 가지 다른 장비는 빠른(최저 10ms) 그리드 준비를 위한 새로운 접근 방식을 사용하여 입자 배향 문제 가능성을 줄입니다. 이러한 장치의 또 다른 장점은 구조 연구를 위한 흥미로운 새로운 개척지인 시간 분해 실험을 수행할 수 있다는 것입니다.

대조적인 접근 방식에서 Nguyen et al.9 은 비용이 많이 들거나 구축하기 어려운 상용 또는 맞춤형 장치가 없는 상태에서 극저온 EM 분석을 위해 그리드를 동결하는 방법을 보고합니다. 그들은 값비싼 장비가 필요하지 않은 값싼 집에서 만든 장치를 사용하여 유사한 품질의 그리드를 얻을 수 있는 방법을 보여 주어 cryo-EM의 민주화에 기여합니다.

cryo-EM에서 관심 샘플은 항상 단백질이 아니라 작은 분자 또는 전체 세포와 같은 큰 생물학적 시스템일 수 있습니다. 이러한 샘플의 준비는 독특하며 특정 단계와 데이터 수집의 다양한 전략이 필요합니다.

마이크로크리스탈 전자 회절(MicroED)의 경우 연구할 샘플은 일반적으로 분말 형태로 발견되는 작은 화학 물질입니다. 분말은 결정 형태를 유지하기 위해 EM 그리드에 직접 적용됩니다. 그런 다음 데이터 수집은 Martynowycz 및 Gonen10에 표시된 대로 회절 모드에서 수행됩니다. 대조적으로, 전체 세포는 cryo-EM 분석에 비해 너무 두껍습니다. 이 문제를 해결하기 위해 Bisson et al. 구조 연구에 적합한 얇은 단편을 얻기 위해 SEM을 사용하여 이러한 샘플에 물리적으로 드릴링하는 방법을 보고합니다11.

샘플에서 구조에 이르기까지 단백질 농도에서 현미경 설정 및 데이터 분석에 이르기까지 각 단백질 샘플에 대해 많은 매개변수가 변경되므로 공정의 각 단계에 대한 기록을 유지하는 것이 중요합니다. 이를 위해 Wypych 등12 는 사용자가 워크플로를 구성하고 향후 출판물에 필요한 모든 세부 정보를 추적할 수 있는 웹 기반 정보 관리 도구를 개발했습니다. 이는 특히 산업 환경에서 극저온 EM에서 자동화가 점점 더 보편화되고 있기 때문에 특히 중요합니다.

Cryo-EM은 지난 10년 동안 하드웨어와 소프트웨어 측면에서 뛰어난 속도로 발전해 왔습니다. 모범 사례의 광범위한 보급과 새로운 방법의 광범위한 채택을 보장하려면 투명한 프로토콜 세트가 필요합니다. 이번 특집호는 이러한 노력에 기여할 것입니다.

감사의 글

JB는 BBSRC(BB/R009759/2) 및 HFSP(RGY0080/2021)의 자금 지원을 인정합니다.

참고문헌

  1. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. Smith, M. T. J., Rubinstein, J. L. Beyond blob-ology. Science. 345 (6197), 617-619 (2014).
  3. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. 91, 1-32 (2022).
  4. Wigge, C., Stefanovic, A., Radjainia, M. The rapidly evolving role of cryo-EM in drug design. Drug Discovery Today. Technologies. 38, 91-102 (2020).
  5. Tachibana, C. Democratizing cryo-EM: Broadening access to an expanding field. Science. 367 (6484), 1394(2020).
  6. de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. Preparation of sample support films in transmission electron microscopy using a support floatation block. Journal of Visualized Experiments. (170), e62321(2021).
  7. Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (177), e62199(2021).
  8. Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-Electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. (168), e62271(2021).
  9. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765(2022).
  10. Martynowycz, M. W., Gonen, T. Microcrystal electron diffraction of small molecules. Journal of Visualized Experiments. (169), e62313(2021).
  11. Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Fleck, R. A. Preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments. (174), e62350(2021).
  12. Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, an information management system for CryoEM experiments. Journal of Visualized Experiments. (172), e62377(2021).

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