고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.
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이 논문에서
요약
초록
다세포 유기체에서 발달 프로그래밍 및 환경 반응은 다른 세포 유형 또는 세포 내에서도 매우 다양할 수 있으며, 이를 세포 이질성이라고 합니다. 최근 몇 년 동안 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술과 결합된 단일 세포 및 세포 유형 분리는 단일 세포 분해능에서 생물학적 과정을 연구하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 그러나 식물 세포를 분리하는 것은 식물 세포벽의 존재로 인해 상대적으로 더 어려우며, 이는 식물에서 단일 세포 접근법의 적용을 제한합니다. 이 프로토콜은 식물 세포를 사용한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기반 단일 세포 및 세포 유형 분리를 위한 강력한 절차를 설명하며, 이는 다운스트림 다중 오믹스 분석 및 기타 연구에 적합합니다. 애기장 대 뿌리 형광 마커 라인을 사용하여 목부-극 페리사이클 세포, 측면 뿌리 초기 세포, 측면 뿌리 캡 세포, 피질 세포 및 내배엽 세포와 같은 특정 세포 유형이 어떻게 분리되는지 보여줍니다. 또한, Smart-seq2를 이용한 효과적인 다운스트림 전사체 분석 방법도 제공된다. 세포 분리 방법 및 전사체 분석 기술은 다른 세포 유형 및 식물 종에 적용할 수 있으며 식물 과학 분야에서 광범위한 응용 가능성을 가지고 있습니다.
서론
세포는 모든 생명체의 기본 단위이며 구조적 및 생리적 기능을 수행합니다. 다세포 유기체의 세포는 명백한 동시성을 나타내지만, 다른 유형과 개별 세포의 세포는 발달 및 환경 반응 동안 전사체에 차이를 나타냅니다. 고처리량 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 세포 이질성을 이해하는 데 있어 전례 없는 성능을 제공합니다. 식물 과학에 scRNA-seq를 적용하면 식물 세포 아틀라스1을 성공적으로 구성하는 데 기여했으며, 식물 조직2에서 희귀 세포 분류군을 식별하는 데 사용되었으며, 식물 조직의 세포 유형 구성에 대한 통찰력을 제공하고, 식물 발달 및 분화 중에 사용되는 세포 정체성 및 중요한 기능을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 식물 조직(1,2,3)에서 시공간 발달 궤적을 추론하여 새로운 마커 유전자4를발견하고, scRNA-seq를 사용하여 중요한 전사 인자5의 기능을 연구하여다른 식물3에서 동일....
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프로토콜
다음 프로토콜은 목부-극 페리사이클 세포(J0121), 측근 초기 세포, 외측 뿌리 캡 세포(J3411), 내피 및 피질 세포(J0571)(그림 1A)와 같은 뿌리 세포 유형에 대한 형광 및 형광 마커 라인이 없는 A. thaliana 야생형(WT) 종자에 최적화되었습니다. 이전에 발표된 보고서14에 이어 야생형 애기장대 식물에 GATA23 프로모터 구동 GFP 구축물을 도입함으로써 생성된 측근 개시 세포 마커 라인을 제외한 모든 마커 라인은 상업적 공급원(재료 표 참조)으로부터 수득하였다.
1. 식물 재료의 준비
- A. thaliana WT 종자 및 형광 마커 라인 종자를 실온의 회전 배양기에서 20% 표백제로 15분 동안 배양하여 살균합니다.
- 씨앗을 이중 증류수 (ddH2O)로 3-5 회 헹굽니다. 멸균된 깨끗한 벤치에서 이 단계를 수행합니다.
- WT 및 리포터 라인 시드를 0.8% 한천(w/v)15의 절반 강도 Murashi....
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결과
원형질체 분리
이 프로토콜은 형광 A. thaliana 루트 마커 라인의 원형질체 분류에 효과적입니다. 이러한 마커 라인은 형광 단백질과 표적 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 유전자를 융합하거나 인핸서 트랩 라인을 사용하여 개발되었습니다(그림 1). 수많은 조직과 기관이 모델 식물과 작물에서 특정 형광 마커를 발현하는 세포 유형으로 해부되었습니다.
FACS 모집단, 분류된 세포 및 라이브러리 QC
야생형 식물을 대조군으로 사용하고 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)과 같은 게이트를 설정하여 관심 세포의 주요 집단과 자가형광 기준선을 결정하고 형광 특이적 표시 세포를 성공적으로 분류했습니다(그림 2). 최종 시퀀싱 라이브러리의 품질(단계 4.15로부터)은 단편 크기 분포 분석에 의.......
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토론
Smart-seq2 기반 프로토콜은 수백개의 셀(8)로부터 신뢰할 수 있는 시퀀싱 라이브러리를 생성할 수 있다. 출발 물질의 품질은 전사체 분석의 정확성에 필수적입니다. FACS는 관심 세포를 준비하기 위한 강력한 도구이지만, 이 절차, 특히 원형질체 단계는 식물 응용 분야에 최적화되어야 합니다. 레이저 포획 미세해부(LCM) 또는 수동 해부된 세포도 입력(25,26)으로서 사용될 수 있으므로, 여기에 제공된 프로토콜은 공지된 마커 유전자를 갖거나 갖지 않는 다양한 식물 종 및 세포 유형에서 잠재적으로 사용될 수 있다.
식물 재료의 준비
식물 발달 생물학에서 FACS는 일반적으로 형광 마커를 발현하는 농축 세포 집단을 분리하는 데 사용됩니다. 이러한 마커를 발현하는 식물은 원형질체이며, 원형질체는 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 Shanghai Jiao Tong University 농업 및 생물학 학교의 단일 세포 다중 오믹스 시설에서 이 프로토콜을 설정했으며 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 32070608), 상하이 푸장 프로그램(보조금 번호 20PJ1405800) 및 상하이 자오퉁 대학교(보조금 번호 Agri-X20200202, 2019TPB05).
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재료
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| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| 애질런트 단편 분석기 | Aglient | Aglient 5200 | |
| 애질런트 고감도 DNA 키트 | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP 비드 | BECKMAN | A63881 | |
| 베타인 | 위안예 | S18046-100g | |
| 표백제 | Mr Muscle | FnBn83BK | 20%(v/v) 표백제 |
| BSA | 시그마 | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| 셀룰라아제 R10 | 야쿠르트(일본) | 9012-54-8 | |
| 셀룰라아제 RS | 야쿠르트(일본) | 9012-54-8 | |
| 원심분리기 튜브(1.5mL) | 에펜돌프 | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA 및 RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
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| DTT (0.1 M) | invitrogen | 18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| 필터 팁 (1000 &마이크로; L) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| 필터 팁 (200 &마이크로; L) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| 필터 팁(10 &마이크로; L) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| 필터 팁(100 &마이크로; L) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
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| 만니톨 | 알라딘 | 69-65-8 | |
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참고문헌
- Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
- Denyer, T., et al.
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